doi：10.13360/j.issn.1000-8101.2015.04.016中图分类号：S682
侯娜1，田晓瑞2，娄丽1，王港1*，李从瑞1，杨成华1
（1.贵州省林业科学研究院，贵阳 550005；2.内蒙古根河林业局）
摘要：为了探索荔波唇柱苣苔离体叶片不定芽的诱导及植株再生的最佳培养条件，以叶片为外植体，建立了荔波唇柱苣苔植株的再生体系。结果表明荔波唇柱苣苔叶片外植体的最优消毒方法为：采用70%酒精灭菌30 s，0.1%HgCl2灭菌4 min；叶片诱导丛生芽最佳培养基为：MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均诱导率为85.75%；不定芽增殖最佳培养基为MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA30.5 mg/L，平均增殖系数可达17.67，且不定芽生长良好；生根培养基以1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L为最好，生根率达92.61%。组培苗经炼苗及移栽，成活率达90%以上。建立了荔波唇柱苣苔叶片离体不定芽诱导及植株再生体系，为规模化生产荔波唇柱苣苔提供技术指导。
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关键词 ：荔波唇柱苣苔；离体叶片；不定芽；植株再生
Efficient adventitious bud induction and plant regeneration from leaves of Chirita liboensis
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HOU Na， TIAN Xiaorui，LOU Li，WANG Gang，LI Congrui，YANG Chenghua
Abstract：With the aim of screening the optimum condition of adventitious bud induction and plant regeneration from leaves of Chirita liboensis，we took leaves as explants，researched the effects of different hormones for callus induction and plant regeneration of leaves.The results showed that the optimal way to obtain sterile explant for leaves were sterilized in 70% ethyl alcohol for 30 s then 0.1% HgCl2 for 4 min. The optimal medium for callus of leaves was MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，induction rate was 85.75%.The optimal medium of induction of adventitious buds was MS+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+GA30.5 mg/L，multiplication factor was 17.67，and seedlings grew well. The optimum medium and plant growth substances combination for rooting induction was 1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，rooting rate was 92.61%.Transplant survival rate of plantlet reached more than 90% in humus soil?pearlite（3∶1）.We established the condition of plant regeneration and clonal propagation system and provided technical guidance for the large scale production of C.liboensis.
Key words：Chirita liboensis； detached leaves；adventitious bud； plant regeneration
First author’s address： Guizhou Academy of forestry， Guiyang 550005，China
收稿日期：2015-01-27
修回日期：2015-03-17
基金项目：贵州省科技厅推广项目 （黔科合成字（2012）5033号）。
作者简介：侯娜（1983-），女，工程师，主要从事林木生物技术研究。通信作者：王港，男，副研究员。E?mail：houna1018@163.com
荔波唇柱苣苔（Chirita liboensis）为苦苣苔科唇柱苣苔属植物。唇柱苣苔属植物分布于尼泊尔、不丹、印度、缅甸、我国南部、中南半岛、马来半岛及印度尼西亚，全世界约130种；其中约81种分布在我国的西南、华南地区，向东达浙江、福建、台湾，向北达湖北［1-3］。荔波唇柱苣苔是多年生草本植物，自然分布区狭小，仅产于贵州荔波；其叶片革质或薄革质，叶面有辐射状白色纹理，叶色呈深绿色，花冠蓝紫色，花期5月，色彩绚丽［4-5］，极富观赏价值；此外还具有较强的抗干旱耐瘠薄能力，可作园林绿化地被植物。目前由于对苦苣苔科野生植物资源的过度开发，很多极具观赏价值的唇柱苣苔属植物濒临灭绝，因此中国所有的唇柱苣苔物种均已列入《中国物种红色名录》［6-7］。苦苣苔科植物因花繁色艳、叶片独特及株形紧凑而深受人们喜爱，但有些仍处于深山人未知的状况，尚未进入商品开发阶段，因而具有极大的开发潜力。为满足荔波唇柱苣苔植物商品化生产，最好的方法就是研究荔波唇柱苣苔的快速繁育技术，通过人工快速、大量的繁育，在满足市场对需求的同时，也起到保护野生资源的作用。因此对其植株再生体系的研究具有重要意义。
本研究通过对荔波唇柱苣苔外植体的消毒、诱导、增殖、生根、移栽等环节进行组培试验研究，建立了操作简便、扩繁速度快、成苗率高的荔波唇柱苣苔组培再生体系，为荔波唇柱苣苔植物规模化培育提供技术指导。
1材料与方法
1.1材料来源
试验材料为荔波唇柱苣苔幼嫩叶片，采自贵州省荔波茂兰自然保护区。
1.2试验方法
外植体经流水冲洗2 h，用70%酒精处理30 s和0.1%HgCl2不同处理时间灭菌后无菌水冲洗3～5次，接种于无激素的MS培养基上，附加蔗糖30 g/L和蔗糖5 g/L，调节pH到5.8；每种方法接种30瓶，每瓶1个外植体，接种后在温度（25±2）℃，光照强度1 500～2 000 lx，12 h光照培养。光照培养10 d后，记录外植体污染数和存活数。
1.3叶片诱导丛生芽
将消毒的外植体叶片切成0.5 mm×0.5 mm的小块，接种于添加不同浓度TDZ、NAA的MS培养基上进行培养，进行叶片诱导丛生芽试验。设计NAA浓度为0.1 mg/L，TDZ浓度为0.1，0.3，0.5，0.8和1.0 mg/L 5个浓度梯度，30 d统计不定芽萌芽情况。每个处理10瓶，每个水平重复3次。接种后在温度（25±2）℃，光照强度1 500～2 000 lx，12 h光照培养。
1.4不定芽增殖培养
将诱导出的丛生芽，接种于附加不同浓度的6-BA、NAA、GA3的MS培养基上进行培养。每种激素分别设0.1，0.5 mg/L 2个浓度，30 d统计不定芽分化情况。每个处理10瓶，每个水平重复3次。接种后在温度（25±2）℃，光照强度1 500～2 000 lx，12 h光照培养。
1.5不定芽的生根
待丛生芽生长至4～5片正常叶片时，剪下生长健壮的无菌芽，将不定芽切成单芽，接种于附加不同浓度的IBA及NAA的MS培养基上。每个处理接种10瓶，每瓶接种2个无菌单芽，每个处理重复3次。接种后在温度（25±2）℃，光照强度1 500～2 000 lx，12 h光照培养。观察不定芽生根情况并计算生根率。生根率=生根小苗数/总苗数×100%。
1.6再生植株的炼苗与移栽
将具有4～5条小根的长势良好的荔波唇柱苣苔组培苗逐渐揭开瓶盖，在室内自然条件下炼苗7 d；然后取出组培苗，洗净根部附着的培养基，将小苗移栽到经高锰酸钾消毒的腐殖土和蛭石﹙3∶1﹚混合基质中室内培养。移栽后，每3 d用不含蔗糖和激素的MS液体培养基进行喷施，保证小苗营养生长。
1.7数据处理方法
用Excel 2007进行数据统计处理，用 spss 18.0软件对试验数据进行方差分析，差异显著的则进行多重比较。
2结果与分析
2.1不同消毒方法对成活率的影响
适宜消毒剂和消毒时间对外植体初代培养的成功有直接影响，消毒时间过短易污染，过长对外植体有杀伤作用，消毒处理时应严格控制适宜消毒时间。
在消毒过程中，荔波唇柱苣苔叶片对酒精的敏感度较高，酒精消毒时间过长叶片出现枯黄色斑点，掌握适当的酒精处理时间对获得叶片的无菌外植体非常重要。结果（表1）表明，先用70%酒精消毒30 s，然后用0.1%HgCl2灭菌4 min，污染率较低，成活率最高；当0.1%HgCl2浸泡时间增加至6 min以后，污染率和成活率都下降。故采用70%酒精处理30 s后，再用0.1%HgCl2浸泡4 min，采用这种消毒方法荔波唇柱苣苔叶片能够获得较高的成活率和较低的污染率，也能达到较好的消毒效果。
2.2叶片丛生芽的诱导
荔波唇柱苣苔接种于表2所示的培养基上培养35 d左右形成一团丛生芽（图1A）。试验发现，在前20 d的培养过程中，芽分化和生长速度较慢，但继续培养15 d后，丛生芽的分化数量增多，生长速度加快。在NAA浓度一定，TDZ浓度在0.1～1.0 mg/L之间变化时，叶片丛生芽的诱导率呈先上升后下降的趋势，在0.5 mg/L时，诱导率达到最高，为85.75%；NAA浓度固定不变时，低浓度的TDZ不利于无菌芽的分化，诱导率和平均发芽数随着TDZ浓度的增加先升高后下降，在0.5 mg/L时达到最高；而高于0.5 mg/L时，玻璃化现象严重，诱导率反而下降。因此，NAA浓度为0.1 mg/L时，TDZ浓度为0.5 mg/L更适合诱导丛生芽，诱导率达到最高，为85.75%，平均萌芽数为18.93个。因此，适合叶片诱导丛生芽的最佳培养基为MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。
2.3不同激素浓度组合对不定芽增殖的影响
将初代培养形成的无菌芽苗移入增殖培养基，研究不同激素配比对无菌芽增殖的影响。30 d后统计其增殖情况，并观察不定芽分化数量及不定芽生长状况。荔波唇柱苣苔组培无菌苗增殖主要靠分化不定芽。
根据方差分析及对不同试验处理进行多重比较后，结果（表3）表明不同激素处理组合对荔波唇柱苣苔不定芽增殖的影响表现差异显著。观察比较发现，6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA30.5 mg/L为荔波唇柱苣苔不定芽增殖最佳激素配比，分化不定芽较快，很快形成小植株形态，数量多，部分分生出根，不定芽伸长生长明显；无菌芽在该组合培养基上15 d芽就开始萌动，平均分化不定芽17.67个，在该组合培养基上，接种30 d左右，分化的不定芽形成植株形态，具有3～4片叶（图1B）。
2.4不同浓度激素组合对根诱导的影响
当芽长出4个以上叶片时，将不定芽切成单芽，接种于培养基上，接种15d左右芽苗底部有白色细小短根发生﹙图1C﹚。
根据方差分析及对不同试验号进行多重比较分析，结果（表4）显示不同激素处理组合对荔波唇柱苣苔不定芽生根的影响表现差异显著。各处理的均值大小依次为4（92.61%）>3（73.30%）>2（53.12%）>1（33.33%），说明IBA和NAA组合对荔波唇柱苣苔生根产生一定的影响。荔波唇柱苣苔生根较为容易，在无激素的MS培养基中生长15d左右，生根量较少，由此推测诱导生根的最优组合为4号培养基，即：1/2 MS+NAA 0.1+IBA 0.1 mg/L，植株根系发达，植株生长健壮，须根多，发育良好，生根率平均可达92.61%。
2.5荔波唇柱苣苔再生植株的炼苗与移栽
苗的质量及移栽后的管理对组培苗移栽成活具有很大的影响。选择生长健壮的荔波唇柱苣苔再生植株，逐渐慢慢打开瓶盖，室内培养7 d后，洗掉根上附着的培养基，将小苗移于经高锰酸钾或0.1%甲基托布津消毒的腐殖土和蛭石（体积比3∶1）基质中室内培养，移栽后，每3 d喷洒不加激素、蔗糖和琼脂的MS液体培养基。
室外移栽时，由于荔波唇柱苣苔植株本身对空气相对湿度要求较高，因此荔波唇柱苣苔无菌苗植株正常生长后，每3d浇1次水。荔波唇柱苣苔组培苗经炼苗后，生长迅速，环境适应能力较强，室外移栽成活率达90%以上﹙图1D﹚。
3结论与讨论
一般植物组培苗的发生途径有：不定芽、愈伤组织、器官发生、原球茎等。许多研究是通过外植体直接诱导出不定芽［8］，这种途径可缩短植物再生体系的建立时间。因此在本试验中用叶片作为外植体，直接诱导不定芽，再通过不定芽增殖及生根，建立荔波唇柱苣苔离体叶片的再生体系。
在外植体消毒过程中，发现荔波唇柱苣苔叶片上有短茸毛，在表面消毒时造成一定的困难，加大了灭菌的难度。梁桂友［9］对唇柱苣苔属其他植物组培的研究中，采用花梗作为外植体进行离体快繁的初代培养效果好于幼叶；其他有关研究中采用带苞片的花蕾作为外植体进行组培快繁［10］。但本试验中采用幼叶作为外植体进行离体快繁，用70%酒精灭菌30 s后0.1%HgCl2灭菌4 min消毒，污染率较低，成活率高。因此增加了荔波唇柱苣苔离体培养外植体的来源与数量。
本研究表明，TDZ对丛生芽诱导起主要作用，TDZ浓度为0.5 mg/L有利于诱导率和不定芽数量的提高，浓度质量高于0.5 mg/L时，不定芽玻璃化现象严重；利用不同浓度的激素配比进行不定芽增殖的试验中发现，低浓度6-BA和低浓度NAA配合使用时，有利于不定芽的增殖。
在生根过程中无激素的MS培养基能够诱导不定芽生根，但添加一定浓度的IBA和NAA，更有利于荔波唇柱苣苔的生根，且须根较多，植株生长健壮。室外移栽时，荔波唇柱苣苔的再生植株适应能力较强，对空气相对湿度要求较高，组培苗经驯化后，生长迅速，成活率达90%以上。
唇柱苣苔属植物扦插繁殖速度慢，生根率低，种子繁殖不能保持母本的优良性状［11-12］，因此普通繁殖不能实现快速增殖的目的。而本试验建立的荔波唇柱苣苔离体叶片再生体系不仅扩繁增殖效率高，而且增殖倍数平均可达到18，组培苗生根容易，极大地提高了荔波唇柱苣苔的繁殖速率，为荔波唇柱苣苔的快速繁殖和商品化生产提供了理论依据和技术指导。
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（责任编辑 吴祝华）