赵清梅１，２，余永涛３
（１．北方民族大学生物科学与工程学院，银川 ７５００２１；
２．国家民族事务委员会发酵酿造工程生物技术重点实验室，银川 ７５００２１；３．宁夏大学农学院，银川 ７５００２１）
摘要：采用酸性染料比色法测定苦马豆［Ｓｗａｉｎｓｏｎｉａ ｓａｌｓｕｌａ Ｔａｕｂｅｒｔ（Ｓｐｈａｅｒｏｐｈｙｓａ ｓａｌｓｕｌａ （Ｐａｌｌ．）ＤＣ．）］中总生物碱含量。以苦参碱为标准品，溴麝香草酚蓝为染色液，在ｐＨ ７．６缓冲溶液中与生物碱反应，反应产物用氯仿萃取，萃取液于４１４ ｎｍ处测定其吸光度。应用建立的酸性染料比色法对宁夏不同地区采集的苦马豆样品中总生物碱含量进行分析。结果表明，苦参碱在０．００１ ７～０．０１３ ３ μｇ／μＬ内与吸光度线性关系良好，回归方程为ｙ＝５０．５４９ ０ｘ－０．０４７ ７（Ｒ２＝０．９９９），苦参碱的平均回收率为１０３．１７（ＲＳＤ为１．７０％），测得宁夏平罗县、盐池县、银川市采集的苦马豆中总生物碱质量分数分别为０．０２６％、０．０２４％、０．０１７％。该方法灵敏、可靠、操作简便，可用于苦马豆中总生物碱含量的测定。
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关键词 ：苦马豆［Ｓｗａｉｎｓｏｎｉａ ｓａｌｓｕｌａ Ｔａｕｂｅｒｔ（Ｓｐｈａｅｒｏｐｈｙｓａ ｓａｌｓｕｌａ （Ｐａｌｌ．）ＤＣ．）］；酸性染料比色法；总生物碱；苦参碱
中图分类号：Ｒ９２７．２；Ｏ６５７．３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０７－1710－０3
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.046
苦马豆［Ｓｗａｉｎｓｏｎｉａ ｓａｌｓｕｌａ Ｔａｕｂｅｒｔ（Ｓｐｈａｅｒｏｐｈｙｓａ ｓａｌｓｕｌａ （Ｐａｌｌ．）ＤＣ．）］是豆科苦马豆属草本植物，别名羊卵蛋、羊尿泡、尿泡草、红花苦豆子等，广泛分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海、新疆等地［１］。苦马豆全草、果可入药，民间用于治疗肾炎、慢性肝炎、肝硬化腹水等疾病。苦马豆含有黄酮、生物碱、异环烷、木脂素、酚酸、萜及甾醇类化合物［２］。目前对苦马豆的总黄酮含量进行了深入分析，但总生物碱含量的研究尚未见报道。研究表明，苦马豆中含有苦参碱［３］、苦马豆碱（Sｐｈｅｒｏｐｈｙｓｉｎｅ）［４］、苦马豆素（Ｓｗａｉｎｏｎｉｎｅ）［５］、麦角碱（Eｒｇｏｔｉｎｅ）［１］等多种生物碱，该类生物碱具有调节血压、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调节免疫、治疗产后出血和帕金森病等作用［２，３，６］。因此，测定苦马豆总生物碱含量可对苦马豆的药材质量评价和临床应用提供重要的科学依据。苦马豆也是一种有毒植物，家畜过量采食会导致中毒死亡［７］，给草原畜牧业造成严重的经济损失，有报道生物碱可能是导致动物中毒的重要原因［４］，测定苦马豆中生物碱的含量，也可为动物苦马豆中毒的防控提供科学依据。
目前，用于植物样品生物碱测定的方法有薄层色谱扫描法、高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）、高效毛细管电泳法（ＨＰＣＥ）、重量法、酸碱滴定法、酸性染料比色法等。薄层色谱扫描法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法灵敏度高，测量准确，适用于对植物样品中各生物碱组分的定量分析，但所需设备昂贵，操作复杂，技术要求较高，一般无法检测在紫外可见光区吸收较弱或无吸收的化合物。而重量法、酸碱滴定法的灵敏度较低，误差较大，一般用于总生物碱含量的粗略评估。酸性染料比色法是根据生物碱在一定ｐＨ介质中与酸性染料发生反应，形成可被紫外分光光度计检测的具有生色基团络合物的原理建立的方法，该方法具有灵敏度高、重现性好、操作简便、样品处理简单等特点，近年来已广泛用于苦参、苦豆子等中药材中总生物碱含量的测定［８－１２］。本研究拟以苦参碱为对照品，用酸性染料比色法，对宁夏不同地区采集的苦马豆总生物碱含量进行测定，为苦马豆药材质量评价、临床应用和动物苦马豆中毒的防控提供科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 植物样品 苦马豆全草，采于宁夏平罗县、盐池县和银川市，采集后风干、粉碎备用。
１．１．２ 主要试剂和仪器 苦参碱标准品购自中国食品药品检定研究院，生产批号为１１０８０５－２００５０８；溴麝香草酚蓝、甲醇、乙醇、氯仿、氨水、氯化铵等均为分析纯。ＤＵ８００型紫外分光光度计（美国贝克曼公司）。
１．２ 方法
１．２．１ 苦参碱标准品溶液的制备 标准品溶液的配制：精密称取１０．０ ｍｇ苦参碱标准品，用体积分数为５０％乙醇定容于１０ ｍＬ的容量瓶中，配制成１ ｍｇ／ｍＬ标准品溶液。
１．２．２ 供试样品溶液的制备 称取苦马豆草粉１．００ ｇ，用滤纸包好后放入索式提取器，加入１００ ｍＬ甲醇，８０ ℃提取２４ ｈ，取出提取液，浓缩至干，残渣用５ ｍＬ体积分数为２％乙酸溶液溶解。将乙酸溶液加入装有５ ｇ ７３２型阳离子交换树脂（ＮＨ４＋型）的分离柱中，静置过夜后先加入去离子水洗脱树脂，待洗脱液呈中性时，再用１ ｍｏｌ／Ｌ的氨水溶液洗脱，收集水洗脱液，浓缩至干，用１ ｍＬ乙醇溶解，离心后取上清液用体积分数为５０％乙醇稀释，备用。
１．２．３ 最大吸收波长的确定 分别取标准品溶液２０ μＬ、供试样品溶液１００ μＬ，分别加入具塞试管中，挥干溶剂后，每管中分别加入ｐＨ ７．６的质量体积分数为０．０１２ ５％的溴麝香草酚蓝溶液６ ｍＬ，氯仿６ ｍＬ，然后倒入分液漏斗中剧烈振荡２ ｍｉｎ，静置２ ｈ。取氯仿层溶液，置于紫外分光光度计中，在３００～９００ ｎｍ内扫描，测定其最大吸收波长。
１．２．４ 标准曲线的绘制 取标准品溶液０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ μＬ，分别加入９支具塞试管中并挥干溶剂，按“１．２．３”项下方法处理后，于紫外分光光度计测定其４１４ ｎｍ处的吸光度，以吸光度为纵坐标（ｙ）、苦参碱浓度为横坐标（ｘ）绘制标准曲线，得出线性回归方程并确定线性范围。
１．２．５ 稳定性试验 取标准品溶液６０ μＬ，加入具塞试管中并挥干溶剂，按“１．２．３”项下方法处理后，分别在０、１、２、３、４、６、８、１０、１２ ｈ时测定其４１４ ｎｍ处的吸光度，根据线性回归方程计算样品含量，并计算相对标准偏差（ＲＳＤ）。
１．２．６ 精密度试验 取５份标准品溶液，每份５０ μＬ，加入具塞试管中并挥干溶剂，按 “１．２．３”项下方法进行处理，然后置于紫外分光光度计中测其４１４ ｎｍ处的吸光度，根据线性回归方程计算样品含量，并计算ＲＳＤ。
１．２．７ 加标回收试验 称取已知生物碱含量的苦马豆样品（２６６．３４ μｇ／ｇ）１ ｇ，按“１．２．２”项下方法分别制备样品溶液，将样品溶液平均分为５份，加入苦参碱标准品溶液６０ μＬ。将每份样品溶液加入具塞试管中并挥干溶剂，按“１．２．３”项下方法处理后测其４１４ ｎｍ处的吸光度，根据线性回归方程计算回收率，并计算ＲＳＤ。
１．２．８ 样品含量的测定 精密称取宁夏平罗县、盐池县、银川市采集的苦马豆草粉各３份，每份１ ｇ，按“１．２．２”项下方法制备供试样品溶液，从每份样品溶液中各取１００ μＬ加入具塞试管中并挥干溶剂。按“１．２．３”项下方法处理后在４１４ ｎｍ处测定吸光度，根据线性回归方程计算苦马豆样品中总生物碱的含量。
２ 结果与分析
２．１ 最大吸收波长
经测定，供试样品溶液最大吸收波长分别在３５５和４１４ ｎｍ处有较强吸收，但４１４ ｎｍ处吸收最强（图１）。苦参碱标准品溶液在４１４ ｎｍ处有最强吸收，故本试验采用４１４ ｎｍ作为测定生物碱的吸收波长。
２．２ 标准曲线的绘制
以苦参碱标准品溶液４１４ ｎｍ的吸光度为纵坐标（ｙ），苦参碱浓度为横坐标（ｘ），绘制标准曲线，得到标准曲线方程为ｙ＝５０．５４９ ０ｘ－０．０４７ ７（Ｒ２＝０．９９９），苦参碱检测浓度在０．００１ ７～０．０１３ ３ μｇ／μＬ内与吸光度线性关系良好。
２．３ 稳定性、精密度及加标回收试验
经测定，本方法稳定性试验和精密度试验的ＲＳＤ分别为４．２６％（表１）和５．２９％（表２），说明该方法精密度较好，供试样品溶液在１２ ｈ内较稳定。加标回收试验结果如表３所示，平均回收率为１０4．31％，ＲＳＤ为１．７０％。表明系统误差符合分析条件，测试结果准确度高，可靠性强。
２．４ 样品中生物碱含量的测定
测得宁夏平罗县、盐池县、银川市采集的苦马豆样品中生物碱质量分数分别为０．０２６％、０．０２４％和０．０１７％（表４）。
３ 小结与讨论
试验结果表明，宁夏不同地区采集的苦马豆样品中总生物碱含量差异较大，其中宁夏平罗县和盐池县采集的苦马豆样品中总生物碱含量较高，其生物碱质量分数分别为０．０２６％、０．０２４％，而银川市采集的样品中生物碱含量较低（０．０１７％）。苦马豆广泛分布于中国西北地区，不同的生长环境、气候可能对其生物碱含量产生重要影响。因此，需进一步对我国不同区域苦马豆中生物碱含量进行分析，从而为苦马豆的开发利用提供科学依据。
杨毅恒［１３］用苦参碱为标准品测定苦参药材中生物碱的含量，在ｐＨ ７．６条件下，与溴麝香草酚蓝络合成可被氯仿萃取的有色离子对，在４１７ ｎｍ处有最大吸收，建立的方法专属性强，结果准确可靠。在本试验中，当缓冲溶液ｐＨ为７．６时，苦马豆与溴麝香草酚蓝络合生成可被氯仿萃取的具有生色基团的化合物，在３５５和４１４ ｎｍ处均出现较大吸收峰，其中４１４ ｎｍ处吸收最强。而对照标准品苦参碱与酸性染料反应后，仅在４１４ ｎｍ处有最大吸收峰，故本试验选择４１４ ｎｍ作为苦马豆总生物碱的检测波长。经酸性染料处理的待检溶液在１２ ｈ内较稳定，精密度较好，系统误差较小，测试结果准确度较高，可靠性较强。表明该方法可用于苦马豆总生物碱的定量分析，并测得宁夏平罗县、盐池县、银川市采集的苦马豆中总生物碱质量分数分别为０．０２６％、０．０２４％和０．０１７％。
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