傅丽容，向晓寒，贺 斌，史海涛
（海南师范大学生命科学学院，海口 571158）
摘要：为研究芳香化酶抑制剂（Aromatase inhibitor，AI）Letrozole对中华条颈龟（Mauremys sinensis）性别分化的影响，在（30.0±0．5） ℃下孵化受精卵，孵化20 d时涂抹不同质量浓度Letrozole，出壳稚龟暂养1周后进行性别鉴定。结果表明，去离子水对照组孵化子代稚龟雌性占63．64％，雄性和间性各占13．6％和22．73％，差异极显著（P＜0．01），说明该温度下，中华条颈龟主要产雌性个体；AI处理组雄性率分别为88．89％、92．00％和95．00％，说明诱导雄性转化作用较强（P＜0．01），并且乙醇处理组和AI处理组均不会影响龟卵的孵化率（P＞0．05）和孵化期（P＞0．05）。对AI处理组的性腺进行组织学观察，雌转雄精巢曲细精管发育良好，组织结构典型；未完全雄性化的卵睾体，髓质有少量发育完整的曲细精管，皮层退化成薄薄的一层，组织结构处于睾丸与卵巢之间。在产雌温度下， 性分化前使用AI能较好地诱导中华条颈龟由雌性转为雄性。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：中华条颈龟（Mauremys sinensis）；芳香化酶抑制剂；性腺；性别分化
中图分类号：Q45；Q959.6+3 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1430-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.037
Effects of Aromatase Inhibitor on Sex Differentiation of Mauremys sinensis
FU Li－rong， XIANG Xiao－han， HE Bin， SHI Hai－tao
（College of Life science， Hainan Normal University， Haikou 571158，China）
Abstract：In order to study effect of aromatase inhibitor on sex differetiation of Mauremys sinensis， eggs were daubed under 30.0±0．5 ℃ with aromatase inhibitors（Letrozole） in the 20th day of the hatching period． Sex identification of hatched hatchlings were carried out after holding one week． The results showed that female of hatched offspring was 63．64％， male and intersexual was 13．64％ and 22．73％ with the significant difference（P＜0．01）. Mauremys sinensis produced mainly females． Among the three AI－treated groups，male rates were 88．89％，92．00％ and 95．00％ respectively． The 95％ ethanol treated group and three AI－treated groups did not affect the turtle eggs hatching rate （P＞0．05） and incubation period （P＞0．05）. Histological observation of the gonads of the AI－treated group showed that female turn to male testes seminiferous tubules well developed and organizational structure was typical. There was incomplete masculinization of ovotestis body. A small amount of growth medulla completed seminiferous tubules. Cortical degraded into a thin layer between the or ganizational structure between the testis and ovary． It will provide important and useful information for husbandry and management of the M．sinensis．
Key words： Mauremys sinensis； aromatase inhibitor； sex gonad； sex differentiation
收稿日期：2014－09－29
基金项目：国家自然科学基金项目（31372228）；海南省自然科学基金项目（314078）
作者简介：傅丽容（1964－），女，广东博罗人，教授，主要从事爬行动物生理生化研究，（电话）13006040869（电子信箱）flr@hainnu．edu．cn；
通信作者，史海涛（1963－），男，教授，博士，主要从事两栖爬行动物生态学与保护生物学研究，（电子信箱）haitao－shi@263．net。
龟鳖动物性别决定模式主要为温度依赖型性别决定机制（Temperature－dependent sex determination，TSD），即性别分化取决于胚胎发育过程中温度敏感期（Temperature sensitive period，TSP）的环境温度高低［1］。不利的环境温度能够干扰龟类孵化和性比，性比失调可能使很多物种成为濒危保护动物，甚至导致动物种群的衰落或灭亡［2］。在龟鳖类资源严重破坏的现状下，通过饲养繁殖，使用有效方法控制龟类性别分化，能提高繁育率。在养殖条件下控制龟类性比，通常采取调节孵化温度方法，如有些龟类低温产雄性、高温产雌性［3－5］，或通过外源激素或内源激素调控改变龟类性别。外源雌激素（雌二醇 E2）处理孵化卵，可以诱导雄性温度条件下的胚胎发育成雌性，但外源雄激素睾酮T处理却不能诱导雌性温度条件下孵化的卵发育成雄性，因为雄激素T被芳香化酶（Aromatase）催化后转换成了雌激素E2［6］。AI可以抑制芳香化酶的活性，从而阻止雌二醇的合成，实现龟类性别的转化，将雌性转为雄性，该作用仅发生在基准温度下［7，8］。AI在动物性别控制相关领域有一定研究，如对番鸭性腺分化的研究［9－11］，鱼类性别逆转的研究［12，13］等。
中华条颈龟（Mauremys sinensis）作为本土龟类，主要分布在海南、台湾等地，由于过度猎捕和栖息环境破坏等原因，野生种群数量锐减，其已被列为濒危物种［14］。2009年容银燕等［15］对中华条颈龟性别决定机制进行初步研究，确定其属于TSD机制，低温主要产雄性，孵化率低；高温主要产雌性，孵化率高。因此，本研究在高温（产雌性个体）条件下孵化，于温度敏感期采用AI处理胚胎，研究AI对中华条颈龟性别分化的影响，为解决濒危龟类物种人工繁育问题提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
试验开展于2010和2011年中华条颈龟繁殖季节4～6月，试验用卵为产出2～3 d的受精卵，胚盘明显、正常，全部购自海南省文昌长寿园龟类养殖基地。
1．2 试验药品
试验所用芳香化酶抑制剂来曲唑（Letrozole，Let）片剂为瑞士Novartis产品， 以95％乙醇溶液作为助溶剂， 配制3个不同质量浓度梯度（5、 10、 20 μg/μL）。
1．3 人工孵化和AI处理
试验前采用1∶5 000高锰酸钾溶液浸泡孵化箱、擦拭培养箱。试验设置5个分组：空白对照组（去离子水）、95％乙醇、5 μg/μL AI、10 μg/μL AI、20 μg/μL AI，受精卵随机分组，每组30枚，每个孵化箱15枚，并设置两个平行组。孵化第21天（TSP）使用不同质量浓度Let各5 μL涂抹受精卵，两个对照组进行同样处理。孵化箱（22 cm×16 cm×9 cm）底铺5 cm蛭石，放入受精卵，水平间隔0．5～1．0 cm依次排放，覆盖2 cm蛭石。试验设置孵化温度（30.0±0．5） ℃，保持智能生化培养箱（型号HWS－250，宁波海曙赛福实验仪器厂）空气相对湿度为85％～90％，基质湿度为5％～10％，在孵化箱2 cm处插入水银温度计，以此水银温度计为准控温。7 d后检查，将未受精卵剔除。1．4 组织学分析
孵化稚龟，暂养1周，解剖取性腺，用Bouin’s液固定，石蜡包埋，切片厚度5 μm，苏木精－伊红染色，光镜（MOTIC BA310－T）下观察性腺发育状况，并拍照。
1．5 数据统计分析
数据利用Excel 2003和spss 16．0软件进行处理，均以X±S表示。单因素方差分析（ANOVA）检验AI对孵化期的影响；卡方（χ2）检验AI对孵化率和雄性率的影响。
2 结果与分析
2．1 AI对中华条颈龟孵化率和孵化期的影响
由表1可以看出，95％乙醇与去离子水对照组的孵化率和孵化期均无差异显著性（χ2＝0．02，df＝1，P＞0．05），95％乙醇溶液作为助溶剂不会影响胚胎发育。各处理组孵化率与对照组无显著差异（χ2＝1．20，df＝1，P＞0．05；χ2＝1．11，df＝1，P＞0．05；χ2＝0．46，df＝1，P＞0．05），各处理组孵化期差异不显著。结果表明，在一定浓度范围内，AI不会影响中华条颈龟胚胎发育速度和孵化率。
2．2 AI对中华条颈龟性腺分化的影响
由表2可以可知，去离子水和95％乙醇组均有雌性、雄性和间性个体，整体比较没有差异显著性（χ2＝5．04，df＝2，P＞0．05），雄性率分别为13．64％和14．81％，差异不显著（P＞0．05）；雌性率分别为63．64％和59．26％，间性率分别为22．72％和25．93％，差异不显著（P＞0．05）。 结果表明， 在30 ℃下孵化，中华条颈龟主要产雌性个体，乙醇溶液对性别分化没有影响。AI处理组雄性率均显著高于对照组（P＜0．01），且雄性率随着处理浓度的升高而增加，5 μg/μL AI处理组达88．89％，20 μg/μL AI处理组最高95．24％，说明AI对中华条颈龟性别逆转雄性化的作用效果显著。
2．3 AI对中华条颈龟性腺影响的组织学变化
去离子水对照组和95％乙醇组性腺有卵巢、卵睾体（间性）和精巢，雌性个体卵巢结构典型，卵巢皮层发达，皮层内可见发育良好原始卵泡，髓质部退化形成卵巢腔（图1A、B）；AI处理组仅有精巢和卵睾体，精巢的结构典型（图1C、D、E）：皮层为一薄层呈白膜状，髓质增生，毛细血管丰富，有众多不规则曲细精管切面，曲细精管内清晰可见精原细胞和初级精母细胞。对照组和AI处理组均有卵睾体，对照组卵睾体组织细胞大小相近，未见明显的卵泡和曲细精管分化；AI处理组卵睾体的组织结构（图1F），皮层和髓质分界不明显，皮层中可见零星卵母细胞和初级卵泡，这些卵泡与正常卵巢中卵泡的结构相似，但大小和数目均有所减少；髓质部细胞分裂旺盛，大小相近，密集排列呈束，曲细精管的结构较正常睾丸内曲细精管少，分布较为分散，发育不完善。
3 小结与讨论
AI主要通过抑制或降低芳香化酶活性，阻碍类固醇激素的正常代谢途径，使类固醇激素的生成量发生变化，从而影响脊椎动物正常性别分化和性腺发育，使雄性率增加，或使雌性动物转变成雄性。Crews［7］和Richard-Mercier等［8］用芳化酶抑制剂阻止雌二醇的合成可以引起正在发育的胚胎发育为雄性，而不发育为雌性，认为该作用只发生在基准温度下。不同孵化温度条件下，TSP时期性腺芳香化酶的活性不同，在25 ℃（产生全雄的温度）精巢的分化中，芳香化酶活性很低，在30 ℃（产生全雌的温度）卵巢的分化中，芳香化酶活性达到最高［16］。据容银燕等［15］研究报道，29 ℃条件下孵化中华条颈龟卵，雄性率为13．6％，31 ℃时雄性率为4．2％。本试验在产雌的温度（30 ℃）下孵化，AI也可诱导性腺发育为雄性，雄性率达到90％。说明利用芳香化酶抑制剂Letrozole处理龟胚，可以通过抑制龟胚性腺中芳香化酶活性，抑制雌激素的合成，进而促使雄性生殖细胞增殖，完成性别转化过程。
在提高雄性率的同时不影响孵化率，孵化率仍达到90％以上。说明在龟类养殖中可利用AI控制龟类性别，满足生产需求，提高经济效益，预示芳香化酶抑制剂在生产实践中具有广阔的发展前景。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［1］ BULL J J．Sex determination in reptile［J］． Quart Rev Biol， 1980，55：3－21．
［2］ 龚世平，史海涛，徐汝梅．龟类温度依赖型性别决定的保护生物学意义［J］． 生物学通报，2005，40（3）：8－9．
［3］ 杨 超，聂刘旺．两栖爬行动物性别决定的研究进展［J］．安徽师范大学学报，2003，26（2）：169－172．
［4］ 李 珊．孵化温度对乌龟性别分化影响的研究［D］．长沙：湖南师范大学，2003．
［5］ 朱新平，陈永乐，魏成清，等． 温度对黄喉拟水龟性别决定的影响［J］．生态学报，2006，26（2）：620－625．
［6］ 杜卫国，孙宝珺．爬行动物温度决定性别的现象与机制［J］．生物学通报，2012，47（3）：1－4．
［7］ CREWS D．Temperature－dependent sex determination： The inter－play of steroid hormone and temperature［J］． Zoological Science，1996，13：1－13．
［8］ RICHARD－MERCIER N， DORIZZI M， DESVAGES G． Endocrine sexreversal of gonads by the aromatase inhibitor Letrozole in turtle with temperature－dependent sex determination［J］．Gen Comp Endocrinol， 1995， 100：314－326．
［9］ 杨 巍，张才乔，乔惠理，等．抑制芳香化酶活性对母鸡性腺分化和性行为的影响［J］．中国兽医学报，2003，23（4）：390－393．
［10］ 王利红，顾月琴，张 伟．芳香化酶抑制剂诱导番鸭性别的初步研究［J］．中国家禽学报，2005，9（1）：68－70．
［11］ 顾月琴．芳香化酶抑制剂Formestane和Letrozole诱导番鸭性别分化的研究［D］．南京：南京农业大学，2006．
［12］ 李广丽，刘晓春，林浩然．芳香化酶抑制剂letrozole对赤点石斑鱼性逆转的作用［J］．生理学报，2005，57（4）：473－479．
［13］ 李延伸．芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）仔稚鱼发育及CYP19A基因表达的影响［D］．上海：华东师范大学，2011．
［14］ 汪 松，解 焱．中国物种红色名录（第一卷）——红色名录［M］．北京：高等教育出版社，2004．
［15］ 容银燕，凌 兰，傅丽容，等．孵化温度对中华条颈龟孵化和性别的影响［J］．水产科学，2014，33（4）：191－195．
［16］ PIEAU C．Sexual differentiation of gonads as a function of temperature in the turtle Emys orbicularis：Endocrine function，intersexuality and growth［J］. J Exp Zool，1998，281： 400－408．