潘丽梅１，马小军２，白隆华１，曾雯雯３，冯世鑫１，莫长明１
（１．广西药用植物园，南宁 ５３００２３；２．中国医学科学院／北京协和医学院药用植物研究所，北京 １００１９３；
３．广西大学农学院，南宁 ５３０００４）
摘要：以金果榄（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ ｃａｐｉｌｌｉｐｅｓ Ｇａｇｎｅｐ．）幼嫩茎段为外植体，添加不同浓度的６－苄基腺嘌呤 （６－ＢＡ）、吲哚－３－丁酸 （ＩＢＡ）、萘乙酸（ＮＡＡ）、激动素（ＫＴ）、赤霉素（ＧＡ），研究不同培养基对金果榄试管苗诱导、增殖和生根的影响。结果表明，金果榄启动培养的最佳培养基为ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＫＴ ＋０．１ ｍｇ／ Ｌ ２，４－Ｄ，腋芽诱导率达９５．１％；增殖的最佳培养基为ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＧＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，增殖系数达到１６．１；生根的最佳培养基为１／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，３０ ｄ时生根率为８５．４％，10 d后炼苗移栽到塘泥和河沙（３∶１，体积比）的混合基质中，３０ ｄ后移栽成活率可达８７．３％以上。
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关键词 ：金果榄（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ ｃａｐｉｌｌｉｐｅｓ Ｇａｇｎｅｐ．）；茎段；组织培养；诱导；生根
中图分类号：Ｓ５６７．２３文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1232-03
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．0５．０51
收稿日期：２０１４－０８－１４
基金项目：广西科学研究与技术开发计划应用基础研究专项（桂科基０７３１０３８）
作者简介：潘丽梅（１９８２－），女，广西藤县人，助理研究员，主要从事药用植物组织培养研究，（电话）０７７１－５６１０４６２（电子信箱）ｐｌｉｍｅｉ２００６＠１６３．ｃｏｍ；
通信作者，冯世鑫，研究员，主要从事药用植物栽培（电话）０７７１－５６１０４６２（电子信箱）ｓｈｉｘｉｎ１９９６＠１２６．ｃｏｍ。
金果榄（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ ｃａｐｉｌｌｉｐｅｓ Ｇａｇｎｅｐ．）为防己科青牛胆属常绿缠绕藤本植物，主产于四川、湖南、广西、湖北、贵州等地，具有清热解毒、利咽止痛的功效，主治咽喉肿痛、痈疽疔毒、泄泻、痢疾、脘腹热痛等［１－３］。金果榄块根含掌叶防己碱（Ｐａｌｎｍｔｉｎｅ）和咖伦宾（Ｃｏｌｍｔｆｉｆｉｎ）、巴马汀、药根碱、非洲防己碱、千金藤碱、蝙蝠葛碱和木兰花碱［４－６］等成分，民间广泛用于治疗胃痛。现代药理学研究表明，金果榄有明显的抗炎镇痛、抗菌、抗肿瘤、降血糖、抗应激及解毒等作用，又被喻为可替代抗生素的天然药物［５］。由于长期采挖，金果榄野生资源日趋枯竭，人工种植和抚育势在必行。另外，金果榄雌雄异株，授粉受到环境影响极大，自然结实率低。在资源调查和引种中发现，雄株远多于雌株（约５０∶１），结果机会大大减少，且种子有明显的休眠期，发芽率较低［７］。因此，种源缺乏是金果榄资源锐减的主要原因。目前，金果榄扦插繁殖未获得成功，而组织培养快速繁殖是现代生物技术，且在香蕉、罗汉果、石斛等作物上已取得成功［８－１０］，并应用于生产，但金果榄组培繁殖研究鲜见报道。利用ＭＳ培养基为基础培养基，添加不同浓度和不同种类的激素，在多种植物组织培养中已获得成功。本试验以金果榄的幼嫩茎段为外植体进行消毒，用不同类型植物生长调节物质对丛生芽进行诱导、增殖、生根培养，分析各种植物生长调节物质对金果榄组织培养的影响，从而为金果榄人工繁殖和大规模推广栽培提供有利依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
本试验以广西药用植物园科研圃栽植的金果榄多年生幼嫩枝条为外植体材料。
１．２ 方法
１．２．１ 材料处理 将生长旺盛、无病虫害的金果榄多年生幼嫩枝条剪下，剪成１．５～２．０ ｃｍ长且带芽的茎段，放入０．１％的洗涤剂中浸泡８～１０ ｍｉｎ，然后于自来水下冲洗２０ ｍｉｎ，取出放入经高压灭菌的无菌水中润洗２次。经以上处理后，再将外植体放入７５％的乙醇中消毒３０ ｓ，然后放入０．１％的ＨｇＣｌ２溶液中消毒７ ｍｉｎ， 无菌水冲洗５次。用无菌滤纸吸干材料上的水分， 选择不变色、无褐化的茎段横切成面积为０．８ ｃｍ ×１．２ ｃｍ 的带芽小块，供接种用。
１．２．２ 培养方法
１）启动培养。将经过消毒处理的茎段分别接种在添加了不同组合、不同浓度生长激素的ＭＳ培养基上进行启动培养，生长素的类型及浓度为６－ＢＡ（０．５、１．０、１．５ ｍｇ/Ｌ）、ＫＴ（0.5、1.0、1.5 ｍｇ/Ｌ）、２，４－Ｄ（0、０．1、1.5 ｍｇ/Ｌ），每瓶接种１个茎段，每个处理接种２０瓶，３次重复，培养３０ ｄ后观察记录诱导效果。
２）增殖培养。将在启动培养基上成功诱导出来的芽进行增殖培养，培养３０ ｄ后统计增殖系数。
３）生根培养。将获得的有效不定芽（株高１．５～２．０ ｃｍ）接种于１／２ＭＳ培养基上进行壮苗培养，培养２０ ｄ后转入生根培养基中诱导生根，每个处理接种５株，３次重复，培养３０ ｄ后统计生根情况。
４）培养条件。所述培养基均为ＭＳ基本培养基（含２６ ｇ／ Ｌ蔗糖、５．０ ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ ５．８），培养温度为（２５±２）℃ 、光照时间为１２ ｈ／ｄ （日光灯，光照度２ ０００ ｌｘ ）。
２ 结果与分析
２．１ 金果榄茎段启动培养
由表１可知，不同组合生长激素对金果榄茎段的启动培养效果不同，带腋芽的茎段培养１０ ｄ左右有不同程度的萌发，６－ＢＡ和ＫＴ均能起到较好的诱导作用，当６－ＢＡ浓度为１．０ ｍｇ／Ｌ，ＫＴ浓度为０．５ ｍｇ／Ｌ，２，４－Ｄ浓度为０．１ ｍｇ／Ｌ时，金果榄茎段诱导率达到９５．１％，但当6-BA浓度一定，KT和2，4-D浓度过高时，诱导的部分丛生芽出现玻璃化现象。培养基中添加２，４－Ｄ后，芽的长度明显增长，但部分出现愈伤组织，说明６－ＢＡ和ＫＴ为金果榄腋芽诱导的主要因素，而２，４－Ｄ对腋芽的诱导作用不大，其主要作用在于愈伤组织的诱导。金果榄茎段腋芽萌发的最适培养基为ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＫＴ ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ。
２．２ 金果榄茎段增殖培养
将金果榄带芽茎段接种于附加不同浓度的６－ＢＡ和一定浓度ＧＡ、ＮＡＡ的ＭＳ培养基中，每个处理接种３０瓶，每瓶接种３个茎段，经过２～３周培养可形成大量丛生芽。结果表明（表２），在４号培养基ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＧＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ上，金果榄丛生芽增殖系数最大，达到１６．１，芽生长状况也较好，虽然５号培养基中丛生芽的生长状况也良好，但其增殖系数比４号培养基低，且出现了少量的愈伤组织，而在不添加任何激素的基本培养基上培养，金果榄丛生芽增殖系数最低，且生长缓慢，丛生芽较细弱。
２．３ 壮苗与生根
将４号增殖培养基上诱导出来的金果榄丛生芽接种到壮苗培养基（添加０．５ ｇ／Ｌ活性炭、０．１ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ）上进行壮苗培养，２０ ｄ左右苗可长粗、长壮，然后将长至３～５ ｃｍ高的健壮试管苗接种于１～９号生根培养基中， ２０ ｄ 左右，苗基部根原基突起；一个月后，从根原基上长出白色新根，每株生根４～１０条，根长２．３～７．５ ｃｍ。
不同浓度的生长激素及其组合均能诱导组培苗生根，但不同生长激素及其组合诱导苗生根的表现不同。如表３所示，只添加ＩＢＡ的情况下，随着ＩＢＡ浓度的增加，金果榄丛生芽生根率提高，生根速度加快，与对照存在明显差异，但根较细小，容易折断，不利于移栽成活；只添加ＮＡＡ的情况下，金果榄丛生芽生根虽比只加ＩＢＡ的粗，但生根数减少；以ＮＡＡ与ＩＢＡ配合使用可提高金果榄生根率，其生根速度也加快，根粗，根数多，平均生根数最大为９．８±２．３３。因此，综合各项指标，在诱导金果榄生根时，以３号生根培养基1/2 ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ为佳，接种后２１ ｄ即开始生根，３０ ｄ时生根率为８５．４％，４０ ｄ后可达９５％以上。
２．４ 炼苗和移栽
炼苗、移栽基质和光照度对瓶苗移栽成活率都有很大影响，金果榄苗高约５ ｃｍ时开始炼苗。移栽前先闭瓶炼苗６ ｄ，再将培养瓶盖打开，放到全天自然光照，温度２５ ℃的通风条件下炼苗３ ｄ，移栽时用镊子将试管苗从培养瓶中取出，洗干净根部培养基，放入添加了２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的无菌水中浸泡１０ ｍｉｎ，移栽入已灭菌过的基质中（塘泥∶河沙＝３∶１，体积比）， 移栽后７～１０ ｄ用塑料薄膜保湿，上面再覆盖一层报纸，保持光照度以遮光率为６０％左右为宜，空气湿度８５％以上，每天喷雾１次，１０ ｄ左右长出新根，移栽成活率达８７．３％以上。
３ 小结与讨论
金果榄启动培养的最佳培养基为ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＫＴ ＋０．１ ｍｇ／ Ｌ ２，４－Ｄ，其中６－ＢＡ和ＫＴ为腋芽诱导的主要因素；金果榄茎段增殖的最佳培养基为ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＧＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，生根的最佳培养基为1/2 ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，接种２１ ｄ后可开始生根，３０ ｄ时生根率为８５．４％，可边炼苗边生根，１0 ｄ后移栽，30 ｄ后移栽成活率可达８７．３％以上。
在金果榄继代增殖试验中，在６－ＢＡ浓度一定的情况下，添加ＧＡ可大幅度提高芽的增殖系数；添加ＮＡＡ对芽的增殖和芽体生长有一定的改善作用。６－ＢＡ虽是决定芽增殖系数的主要因素，但每一种植物都有合适自身分化和生长的浓度，浓度过高会抑制芽的分化和生长。组培苗生产的关键是瓶苗的移栽成活率，因为瓶苗在培养室内有人工提供的适宜温度、丰富的养分和充足的水分，组培苗一旦脱离这些优越的条件，接受外界自然生长环境，外界环境的温度、湿度变化较大，因此移栽措施不当就会造成组培苗的死亡［１１，１２］。而瓶内生根能大大提高其移栽成活率，当根长为１ ｃｍ左右时移栽最佳。金果榄常规的繁殖方式多以种子传播为主，但其种子有明显的休眠期，发芽率低，采用组织培养已成为其种苗繁育的重要途径，因此提高组培苗的移栽成活率就显得至关重要，该研究可为金果榄的产业化生产提供理论与技术支撑。
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（责任编辑 赵 娟）