徐丹丹ａ，王丕武ｂ，赵邯郸ａ，刘 双ａ，陈昭汀ａ，关淑艳ａ
（吉林农业大学，ａ．生命科学学院；ｂ．农学院，长春 １３０１１８）
摘要：以根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＥＨＡ１０５介导外源基因ｐｈｙＡ转入玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）自交系ＧＳ０１的胚性愈伤组织， 并利用除草剂（草胺磷）筛选出抗性愈伤组织，培养并获得再生植株。结果表明，菌液浓度及侵染时间显著影响愈伤组织的转化率；不同激素种类及配比对抗性愈伤组织再生植株的影响明显。当菌液浓度ＯＤ６００ ｎｍ为０．６，侵染时间为２０ ｍｉｎ时，抗性愈伤组织的转化率最高，达到了６８．７％，为玉米农杆菌转化并获得再生植株奠定了基础。
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关键词 ：农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）自交系；遗传转化；ｐｈｙＡ基因
中图分类号：Ｓ５１３．０３２ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0465-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.054
玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）是粮食作物中重要的工业原料，在全世界粮食生产中占有举足轻重的地位［１－３］。２０１０年，我国玉米种植面积达到了３２４万ｈｍ２，成为世界第二大玉米生产国，而玉米也成为了我国的“谷物之王”［４］。玉米在我国经济生产中占有重要地位，因此大力提高玉米的产量及品质，成为了众多学者积极探寻的问题［５－７］。植酸酶能有效地水解食物以及土壤中植酸态有机磷，释放出生命体可以直接吸收利用的无机磷酸及其铁、钙、锌、镁等盐类，有效地提高了其生物利用率。因此，植酸酶基因克隆及导入受体组织并获得可再生植株对研制植酸酶食品或饲料添加剂、开发高级保健食品和优质饲料、循环利用土壤中有机磷、缓解全球性磷矿产资源危机等具有重要意义［８－１３］。本研究以玉米自交系ＧＳ０１的胚性愈伤组织为材料，将连有根部特异性启动子和植酸酶基因ｐｈｙＡ的载体转入玉米自交系中，对影响农杆菌介导的玉米遗传转化的因素进行探讨，从而确定了农杆菌介导转化的最佳菌液浓度及最佳侵染时间，优化了农杆菌介导玉米遗传转化条件，并成功获得玉米抗性苗，为基因工程育种打下了基础，为获得含有ｐｈｙＡ基因的转基因玉米植株提供了条件，同时为进一步提高玉米的产量及品质的研究奠定了基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 外植体 采用玉米自交系ＧＳ０１的胚性愈伤组织作为遗传转化的受体进行转化，由吉林农业大学生物技术中心实验室提供。
１．１．２ 菌种 含有ｐｈｙＡ基因和玉米根部特异启动子基因构建的重组质粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ的根癌农杆菌ＥＨＡ１０５，由吉林农业大学生物技术中心实验室保存并提供。
１．１．３ 培养基 本试验所用的培养基见表１。
１．２ 方法
１．２．１ 抗性愈伤筛选标记的确定 本研究所构建的表达载体为Ｂａｒ基因的筛选标记，筛选培养采用除草剂筛选的方法，即用草胺磷进行筛选。
１．２．２ 农杆菌介导转化玉米愈伤组织
１）农杆菌菌液的制备。将带有质粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ单菌落，接种于含５ ｍＬ卡那霉素的５ ｍＬ ＹＥＰ液体培养基中，于２７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培养过夜，再转入５０ ｍＬ ＹＥＰ液体培养基中，培养至对数生长期（ＯＤ６００ ｎｍ在０．５～０．６）时，收集菌体，重悬于ＭＳ液体培养基中待用。
２）玉米愈伤组织的诱导。取授粉１２～１６ ｄ的玉米自交系ＧＳ０１的幼穗，先用７５％乙醇消毒８～１０ ｍｉｎ，再用０．５％次氯酸钠浸泡消毒１２～１５ ｍｉｎ，无菌水洗２～５次后，在无菌条件下取幼胚接种于诱导培养基上，２６ ℃暗培养３～４周，产生Ⅰ型愈伤组织，每隔２～３周继代１次，诱导出Ⅱ型胚性愈伤组织，作为农杆菌转化的受体材料。
３）农杆菌转化玉米愈伤组织。将含有质粒ｐＣＡ
ＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ的农杆菌ＥＡＨ１０５的单菌落，接种于ＬＢ液体培养基（含有５０ ｍｇ／Ｌ 卡那霉素）中，２７ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养至对数生长期（ＯＤ６００ ｎｍ达到不同值），收集菌体，用同体积侵染培养基重悬菌体，用此菌液在三角瓶中侵染胚性愈伤组织１５～２５ ｍｉｎ，每隔５ ｍｉｎ振荡１次，然后收集菌体，倒掉菌液，将愈伤组织放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干愈伤组织表面多余的菌液，然后转入共体培养基中（附加２００ μｇ／Ｌ ＡＳ）中２７ ℃暗培养３ ｄ左右。
４）愈伤组织的筛选、分化及植株再生。将愈伤组织移入筛选培养基中（含一定浓度的除草剂），筛选生长旺盛的新鲜的抗性愈伤继代３次（每１５～２０ ｄ左右继代１次），抗性愈伤转至分化培养基中，分化出苗，再转入生根培养基生根。再移栽到培养室盆栽，最后移栽到大田，进行田间栽培。
２ 结果与分析
２．１ 不同菌液浓度对玉米抗性愈伤组织转化率的影响
农杆菌的生长时期不同，侵染能力有很大差别，农杆菌浓度过高或过低都会影响其转化率，本研究分别取ＯＤ６００ ｎｍ为０．５、０．６和０．７用于转化玉米ＧＳ０１愈伤组织。结果表明，农杆菌生长到对数中期时ＯＤ６００ ｎｍ为０．６时具有最高的转化率，在这个时期农杆菌感染能力最强（表２）。
２．２ 不同侵染时间对玉米抗性愈伤组织转化率的影响
利用农杆菌侵染不同玉米愈伤组织时，侵染时间的长短对其转化率也有重要的影响。侵染时间过短，农杆菌不能充分吸附在外植体上，从而降低了抗性愈伤组织转化率；相反，若农杆菌侵染时间过长，由于农杆菌大量繁殖而造成抑菌困难则会使外植体褐化死亡，二者都会降低抗性愈伤组织转化率。因此，对侵染时间进行研究，确定最佳的侵染时间是十分必要的。本研究设定农杆菌侵染时间分别为１５、２０和２５ ｍｉｎ。结果表明，侵染时间为２０ ｍｉｎ时具有最高的抗性愈伤组织转化率（表2）。
２．３ 不同激素对玉米抗性愈伤组织分化及再生的影响
在Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ培养基中分别添加了不同浓度的６－ＢＡ、ＩＢＡ和ＫＴ，研究不同激素单独及配合使用对玉米幼胚愈伤组织的诱导效果（表3）。由表3可看出，Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ ４种培养基对玉米幼胚愈伤组织的分化效果不同，其中Ｂ、Ｃ培养基上的分化率分别为１７．６％和１５．４％，再生率为９．６％和９．１％，即分化培养时，相同条件下，２．０ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ比１．０ ｍｇ／Ｌ的ＫＴ效果好；Ａ、Ｄ两种培养基上的分化率和再生率分别为２０．５％、１９．４％和１８．６％、１４．５％，Ａ培养基上的分化与再生效果要好于Ｄ培养基，即０．８ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ与１．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ配合使用对玉米抗性愈伤的分化和再生效果要好于加入１．０ ｍｇ／Ｌ ＫＴ和１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的培养基；而Ａ、Ｄ两培养基上的分化率和再生率均高于Ｂ、Ｃ两种培养基，说明不同种类和浓度的激素配合使用对抗性愈伤组织分化和再生的效果更好。
３ 小结与讨论
本试验利用农杆菌介导法将ｐｈｙＡ基因导入玉米自交系ＧＳ０１的胚性愈伤组织中，通过Ｂａｒ基因的筛选标记，使用除草剂进行抗性愈伤的筛选，并优化了农杆菌介导的玉米愈伤组织遗传转化条件。结果表明，①当菌液浓度ＯＤ６００ ｎｍ为０．６时，抗性愈伤组织转化率最高；②侵染时间２０ ｍｉｎ为愈伤组织的适宜侵染时间；③不同浓度的激素搭配使用有利于抗性愈伤组织的分化和再生。
农杆菌介导法转化玉米愈伤组织除了受基因型、愈伤组织状态及菌种种类等因素影响外，农杆菌菌液的浓度、侵染愈伤组织时间和添加不同的激素也会对其产生重要的影响。如果农杆菌菌液浓度过低，那么就会导致农杆菌附着于外植体伤口处的浓度低，以至于不能进行充分转化；而菌液浓度过高，那么农杆菌生长已处于对数生长后期，侵染能力会下降，易导致在共培养时农杆菌的过度增长，加大了对愈伤组织的损害，导致了外植体的褐化死亡。如果侵染时间过短，只有很少的农杆菌吸附在外植体上，导致Ｔ－ＤＮＡ不能有效转移或转化的细胞不够多，从而降低了抗性愈伤组织转化率；相反，若农杆菌侵染时间过长，农杆菌会过度繁殖，最终导致农杆菌的污染或因农杆菌毒性过强而使外植体褐化死亡，二者都可以降低抗性愈伤组织转化率［１４－１６］。培养基中添加不同种类和浓度的激素对抗性愈伤组织的分化与也起着重要的作用，在本试验设定条件下，６－ＢＡ对抗性愈伤组织分化及再生的效果比ＫＴ好，不同种类和浓度的激素配合使用对抗性愈伤组织分化和再生的效果好。
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（责任编辑 屠 晶）