乔新荣１，陈 琼１，郭桥燕２，徐长水３
（１．信阳农林学院，河南 信阳 ４６４０００；２．河南省烟草公司平顶山市公司，河南 平顶山 ４６７０００；３．河南大学生命科学学院／植物逆境生物学重点实验室，河南 开封 ４７５００４）
摘要：采用生物信息学方法，以番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＰＨＯＴ２基因序列为探针，比对了烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）ＥＳＴ数据库，并根据获得的同源性较高的ＥＳＴ序列设计引物，ＰＣＲ扩增了烟草Ｋ３２６ ＰＨＯＴ２基因的ｃＤＮＡ片段。结果表明，成功扩增出了ＰＨＯＴ２基因的ｃＤＮＡ片段，并构建了干扰烟草ＰＨＯＴ２基因表达的ＲＮＡｉ表达载体。
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关键词 ：烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）；向光素；克隆；载体
中图分类号：Q781 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０４－０981－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０４．０55
收稿日期：2014-08-08
作者简介：乔新荣（1972-），女，河南新密人，博士，讲师，主要从事植物生理及分子生物学研究，（电话）0376-6698023
（电子信箱）xinrong806@163.com。
光是调节植物生长发育的一个重要环境因子，植物中已分离了４种对不同波长光感知的受体，分别为光敏色素（Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ， ＰＨＹ）［１］， 隐花色素（Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ，ＣＲＹ）［２］，向光素（Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ， ＰＨＯＴ）［３］和Ｚｅｉｔｌｕｐｅ蛋白家族［４］，其中ＰＨＯＴ是感知蓝光的受体蛋白激酶。在模式植物拟南芥中研究表明，ＰＨＯＴ１和ＰＨＯＴ２以功能冗余方式调节弱光下的叶绿体聚积运动（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔ），使吸收光能的叶绿体面积达到最大，提高了弱光下植物的光合作用［５］。而ＰＨＯＴ２强光下单独介导叶绿体回避运动（Ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）［６］，使叶绿体从强光下移开，沿细胞垂周壁排列，与光源平行，保护光合器官免受强光损伤［７］。另外，ＰＨＯＴ２参与调节草莓果实中花青素的积累［８］。
ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， ＲＮＡｉ）技术通过反义ＲＮＡ与正链ＲＮＡ形成双链ＲＮＡ，特异性地降解细胞内同源ｍＲＮＡ，从而阻断靶基因的表达，使靶基因发生沉默，表现出特定基因缺失的表型。ＲＮＡｉ技术可以快速分析靶基因的功能， 这为高效研究植物功能基因组提供了方便， 成为反向遗传学研究的重要工具之一［９］。本研究以烟草Ｋ３２６为材料，克隆了烟草ＰＨＯＴ２基因片段，构建了ＲＮＡｉ干扰载体，为验证ＰＨＯＴ２介导的叶绿体回避运动是高等植物普遍的运动提供了证据，同时也为ＰＨＯＴ２可能参与烟草香气形成、烟叶品质重要调节子的研究奠定了基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料 烟草Ｋ３２６。
１．１．２ 菌种和质粒 大肠杆菌菌株ＤＨ５α，ＲＮＡｉ干扰载体ｐＦＧＣ５９４１为河南大学逆境生物学重点实验室保存；克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ购自宝生物工程（大连）有限公司。
１．１．３ 试剂 限制性内切酶、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ１８引物、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＤＮＡ凝胶纯化回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；高效连接试剂盒Ｓｏｕｌｔｉｏｎ Ｉ和Ｍ－ＭＬＶ反转录酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶购自ＴｏＹｏＢｏ公司；抗生素（Ａｍｐ， Ｋａｎ）购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、普通ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ购自天根生化科技（北京）有限公司。
１．１．４ 引物 本研究使用引物见表１。
１．２ 方法
１．２．１ ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成 取烟草Ｋ３２６幼苗０．１ ｇ，液氮研磨，利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂进行ＲＮＡ提取，提取的总ＲＮＡ用ＤＮａｓｅⅠ处理去除ＤＮＡ污染，并从电泳检测其质量，合格的总ＲＮＡ进行反转录，合成ｃＤＮＡ 第一链，－２０ ℃保存备用。
１．２．２ 烟草ＰＨＯＴ２基因ｃＤＮＡ片段扩增 以番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＰＨＯＴ２基因序列（ＣＤＳ）作为探针， 在ＴＩＧＲ网站上ＢＬＡＳＴ搜索烟草ＥＳＴ数据库，获得与探针序列同源性较高ＥＳＴ序列，进行引物设计。以烟草Ｋ３２６ ｃＤＮＡ为模板，利用引物Ｆ１和Ｒ１进行ＲＴ－ＰＣＲ。将 ＰＣＲ产物克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，将经菌落ＰＣＲ和质粒ＰＣＲ鉴定后得到的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
１．２．３ ＲＮＡｉ表达载体的构建、鉴定与转化 根据测序结果，以克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体的重组质粒为模板，以引物Ｆ２和Ｒ２作为正向引物，Ｆ３和Ｒ３为反向引物。将引物Ｆ２和Ｒ２进行ＰＣＲ扩增的片段与ｐＦＧＣ５９４１ＲＮＡｉ载体进行连接、转化及酶切验证后，将得到的重组质粒ｐＦＧＣ５９４１－Ｔ１测序验证。然后按照相同的方法，将Ｆ３和Ｒ３引物扩增的相同片段克隆至测序正确的ｐＦＧＣ５９４１－Ｔ１质粒上，经检验测序正确后，用于后续试验。
２ 结果与分析
２．１ 总ＲＮＡ的提取
总ＲＮＡ质量的优劣是反映反转录ｃＤＮＡ完整性的重要因素，同时也是扩增较长ＣＤＳ片段的基础。利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取烟草Ｋ３２６幼苗的ＲＮＡ后，利用２００ Ｖ电压，１％琼脂糖非变性凝胶电泳检测（图１）。由图１可以看到，提取到３条清晰的条带分别为２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ及５．８Ｓ ＲＮＡ，表明提取的ＲＮＡ完整性较好。利用核酸分光光度计测定ＲＮＡ的ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ ｎｍ介于１．８～２．０之间，表明无蛋白质和苯酚污染，说明ＲＮＡ的纯度比较高。而后以此ＲＮＡ为模板、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ１８为引物，用Ｍ－ＭＬＶ反转录酶进行ｍＲＮＡ的反转录，扩增得到ｃＤＮＡ。
２．２ ＰＨＯＴ２基因ｃＤＮＡ片段的克隆与测序
以Ｆ１和Ｒ１为引物，烟草Ｋ３２６ ｃＤＮＡ为模板，利用高保真ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶ＲＴ－ＰＣＲ克隆了ＰＨＯＴ２基因ｃＤＮＡ片段。ＲＴ－ＰＣＲ扩增条件为９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性４０ ｓ， ５７ ℃退火４０ ｓ， ６８ ℃延伸２ ｍｉｎ，共３０个循环；６８ ℃延伸１０ ｍｉｎ，ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物如图２所示。将ＲＴ－ＰＣＲ产物“加尾”后，用凝胶回收试剂盒回收并连接到ｐＭＤ１８－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ载体上，经测序ｃＤＮＡ片段大小为２ ０５２ ｂｐ。
２．３ PHOT2基因ｃＤＮＡ片段的生物信息学分析
利用ＮＣＢＩ中的ＯＲＦ软件分析表明，该ｃＤＮＡ序列含有一个连续的开放阅读框（图３），可编码６７０个氨基酸。经ＢＬＡＳＴ同源性序列比对， 核苷酸序列与番茄ＰＨＯＴ２基因序列同源性达９２％，推断的氨基酸序列与番茄ＰＨＯＴ２氨基酸序列同源性达９１％。利用ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ工具预测分析，所编码蛋白有蓝光受体ＰＨＯＴ家族的功能结构域特征［２］，即Ｎ端包含有两个光感受区ＬＯＶ１和ＬＯＶ２， Ｃ端有一个进行磷酸化的激酶区（图４）。因此，推测该序列是烟草ＰＨＯＴ２基因的部分片段。
２．４ 烟草ＰＨＯＴ２基因ＲＮＡｉ干扰表达载体构建
以烟草ＰＨＯＴ２基因ｃＤＮＡ序列为模板，ＰＣＲ扩增出约４４５ ｂｐ正向片段ＰＨＯＴ２Ａ（含ＸｈｏＩ和 ＮｃｏＩ酶切位点）和反向片段ＰＨＯＴ２Ｂ（含Ｓｍａ Ｉ和ＢａｍＨ Ｉ酶切位点）（图５）。ｐＦＧＣ５９４１载体和正向片段ＰＨＯＴ２Ａ（含ＸｈｏＩ和ＮｃｏＩ酶切位点）连接后转化大肠杆菌ＤＨ５α中，并将反向片段ＰＨＯＴ２Ｂ连接到重组质粒ｐＦＧＣ５９４１－ＰＨＯＴ２Ａ中，酶切鉴定重组质粒ｐＦＧＣ５９４１－ＰＨＯＴ２ Ａ－ＰＨＯＴ２Ｂ构建成功（图６）。
３ 小结与讨论
利用目的基因缺失或表达沉默、超表达及同家族相关基因突变关联等方法获得遗传材料是目前研究基因功能的重要手段。ＲＮＡｉ技术的序列特异性、高效性和多效性，为大规模高效研究复杂的基因功能提供了技术平台。ＲＮＡｉ既可对同一基因家族内不同成员进行分别沉默，也可用于对整个家族进行有效沉默［１０－１２］。ＲＮＡｉ高效表达载体发夹结构最佳片段在２００～６００ ｂｐ之间，片段太短不利于构建载体操作，而且太短的双链ＲＮＡ不能被ＤＩＣＥＲ酶很好识别；而太长的片段在构建中容易引起重组，致使双链ＲＮＡ结构上不太稳定。选择的序列位置可以是靶基因开放阅读框的全部或者部分序列，也可以是３′端、５′端的非翻译区［１３］。
近年来，随着人们对植物蓝光受体及下游信号转导介导子的分离及鉴定，蓝光受体ＰＨＯＴ调节植物生长发育信号转导机制及挖掘其新功能的研究已成为研究者关注的热点之一。本研究以烟草的同科植物番茄的ＰＨＯＴ２基因序列为探针，克隆了一段烟草ＰＨＯＴ２基因序列，通过生物信息学预测，该片段已含有ＰＨＯＴ家族的功能区，构建了该基因的ＲＮＡｉ表达载体，为该基因功能研究奠定一定基础。由于同一家族的ＰＨＯＴ１和ＰＨＯＴ２序列同源性较高，烟草的ＰＨＯＴ１基因还没有克隆。因此，所构建的ＰＨＯＴ２ ＲＮＡｉ表达载体也有可能抑制ＰＨＯＴ１的表达。
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（责任编辑 屠 晶）