张翼，廖浩，赵秀云
（华中农业大学生命科学技术学院，武汉４３００７０）
摘要：为从中国江河、海水等水体中筛选油脂含量较高的微藻，采集了青岛海水、武汉南湖水的水样，分离了１２株微藻。对微藻的油脂含量进行了测定，其中油脂含量最高的微藻为Ｈ２－１，油脂含量达到5６．２５％细胞干重，其次是ＢＱ６，油脂含量为３１．４３％。ＢＱ１、ＢＱ２、ＢＱ４、ＢＱ６油脂含量也较高，达２９％左右。ＰＣＲ扩增获得微藻１８Ｓ ｒＤＮＡ的部分片段，序列测定后，进行ＢＬＡＳＴ同源性分析。结果表明，ＱＳ１、ＱＳ２、ＱＳ３、ＢＱ１、ＢＱ２、ＢＱ３、ＢＱ４、ＢＱ５、ＢＱ６、Ｈ１－１、Ｈ２－２均属于小球藻属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐｐ．），Ｈ２－１属于胶网藻属（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ ｓｐ．）。该研究将为中国生物能源的生产和开发提供优良的藻种资源。
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关键词 ：微藻；油脂；鉴定；小球藻；生物能源
中图分类号：Ｓ９６８．４文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０3－0574－０4
生物能源是由活的生物体或其代谢产物产生的。第一代生物能源来自于玉米、大豆、甘蔗。第二代生物能源来源于纤维素类物质，木材废料如锯末，农业废料如玉米秆、小麦秸秆、快速生长的草和木材等。第三代生物能源来自于藻类（Ａｌｇａｅ）、蓝藻。藻类种类很多，包括单细胞的微藻、多细胞的大型藻类，存在于多种水体中，包括淡水、海水。微藻（包括绿藻、硅藻、蓝藻等）含有高水平的脂类，是发展生物能源的极佳生物来源。某些藻类含４０％脂肪酸，这些脂肪酸能被提取并转化为生物燃料。目前已发现多种能作为生物能源的藻类，包括Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ ｃａｒｔｅｒａｅ、
Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ［１，２］。与陆地植物相比，藻类每单位面积可产生８～２４倍生物柴油，使藻类位于生物柴油的首要地位。每公顷藻类可生产２０ ０００～１００ ０００ Ｌ油脂。而玉米每公顷仅产１７２ Ｌ油脂，大豆每公顷产４４６ Ｌ油脂，花生每公顷可产１ ０５９ Ｌ油脂。可见，藻类与目前种植的植物相比，其单位面积可产２０倍及更多的油脂。且藻类生长迅速，某些藻类在一天中能繁殖１～３代。微藻具有的这些优点，使其受到科研工作者的青睐。美国通过基因工程获得的小环藻，在实验室条件下，其脂质含量增加到占干重的６０％以上，户外生产可达到４０％以上［３－５］。
中国有着丰富的藻类资源，微藻无疑是制备生物柴油原料的优良替代品，具有广阔的开发前景。微藻热解所得的燃油热值高达３３ ＭＪ／ｋｇ。异养培养小球藻，并优化其培养条件后，可获得５７．９％的燃油，是自养培养小球藻所产生燃油的３．４倍［６］。
然而，从藻类生产油脂仍处在实验室阶段，或者田间试验阶段，主要是因为藻类油脂的实际产量要比理论值低90%~95%，使得藻类生物油的生产成本非常高昂。本研究对中国水域中微藻进行筛选，寻找富油藻类，通过研究其生长特性、脂肪酸成分，寻找适合作为生物柴油原料的藻类。
１材料与方法
１．１藻种
微藻由本实验室从青岛海水、武汉南湖水中筛选获得，共计有１２株。
１．２培养基
从海水中筛选微藻采用Ｌ１海水培养基培养［７］，从南湖水筛选的微藻采用ＢＧ１１和ＴＡＰ培养基培养［８］。
１．３微藻的培养
从采集的水样中分离微藻，采用藻类培养用的人工培养基进行培养，在光照度３ ０００ ｌ ｘ，光暗比为１２ ｈ∶１２ ｈ，（２５±１） ℃温度条件下培养。每天摇动 ２～３次，１５ ｄ后离心，收集藻泥，真空冷冻干燥，藻粉于 －２０ ℃保存备用。采用超声波破碎处理细胞以提取油脂。
１．４油脂含量的测定
油脂的提取参照Ｂｌｉｇｈ等［９］的方法：在离心管中加入一定重量的（Ｗ）干藻粉、氯仿－甲醇（２∶１）混匀，于２５ ℃放置２４ ｈ。涡旋 ２ ｍｉｎ，于３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ。在上清液中加入氯仿－甲醇混合液（２∶１），涡旋，于３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ。收集上清液，在７０ ℃烘箱中烘干至恒重（Ｗ１）。
油脂含量＝Ｗ１／Ｗ×１００％
１．５微藻的分类鉴定
对分离的富油微藻进行形态鉴定和分子鉴定。显微镜观察微藻的细胞形态。用ＣＴＡＢ 法提取微藻细胞的ＤＮＡ［１０］。取２００ ｍｇ培养至对数期的微藻样品置于１．５ ｍＬ的离心管中，加入６００ μＬ ＣＴＡＢ缓冲液（２％ ＣＴＡＢ，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ·ＨＣｌ，ｐＨ ８．０，１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，２％巯基乙醇），混匀，于６５ ℃水浴保温１ ｈ。取出后加等体积ＰＣＩ提取液（苯酚／氯仿／异戊醇体积比为２５∶２４∶１），混匀，４ ℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ。取上清液转至新的离心管中，加入２倍体积无水乙醇，室温下放置１０ ｍｉｎ，沉淀ＤＮＡ。４ ℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，弃上清液，用７０％乙醇洗涤ＤＮＡ沉淀２次。晾干，将ＤＮＡ溶解于２０ μＬ ＴＥ缓冲液（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ·ＨＣｌ， １ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）中。
以提取的微藻基因组ＤＮＡ为模板，参照Ｔｉｍｍｉｎｓ等［１１］的方法设计引物扩增微藻１８Ｓ ｒＤＮＡ序 列。采用的引物序列为：Ｆ ５′－ＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣ－３′；Ｒ ５′－ＴＣＣＴＧＧＴＴＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣ
Ｃ－３′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ＰＣＲ反应程序为：９５ ℃变性 ５ ｍｉｎ；９５ ℃变性 ４５ ｓ，５０ ℃退火 ４５ ｓ，７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ，３０ 个循环；７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ。ＰＣＲ 反应体积为 ５０ μＬ，其中包括ＤＮＡ 模板 １００ ｎｇ、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０．４ μＬ（２Ｕ）、引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ） 各 ２ μＬ、 ｄＮＴＰs（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）４ μＬ、１０ ×PCR Ｂｕｆｆｅｒ ５．０ μＬ、 ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）３．０ μＬ 和 ｄｄＨ２Ｏ ３１．６ μＬ 。ＰＣＲ 扩增产物以 １．０％ 琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的 ＤＮＡ 片段，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测定序列后，在 ＮＣＢＩ网站上（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）用 Ｂlast进行同源分析。并构建系统发育树，确定其分类地位。
１．６绘制生长曲线
培养微藻，每隔１２ ｈ取微藻培养液。以空白培养液为参照，测定藻液在７５０ ｎｍ的吸光度。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制微藻的生长曲线。
２结果与分析
２．１微藻的分离
分别从青岛海水、南湖水采集水样，共分离到１２株微藻。所得到的藻株生长速度较快，一般生长３ ｄ即达到稳定期。对微藻ＢＱ５和ＢＱ６的生长曲线进行了测定。由图１可知，ＢＱ６生长迅速，培养７２ ｈ吸光度达到最高，之后下降。ＢＱ６培养４８ ｈ后进入稳定期。
２．２微藻的油脂含量
对微藻的油脂含量进行了测定，结果如表１。在光照培养箱２８ ℃下培养至稳定期收集藻体，测定油脂含量。其中油脂含量最高的微藻为Ｈ２－１，油脂含量达到5６．２５％细胞干重。其次是ＢＱ5，油脂含量为３１．４３％。此外，ＢＱ１、ＢＱ２、ＢＱ４、ＢＱ6油脂含量较高，在２９％左右。由于Ｈ２－１的生物量较少，生长时间比较长，在相同的培养条件下只得到０．１６ ｇ干重的藻体，综合微藻BQ5，BQ6的生长曲线所以选择ＢＱ６作为遗传改造的目标藻株。小球藻与已有文献所报道的小球藻的油脂含量在 １５％～５５％ 范围内的研究结果较一致。
２．３微藻的分子鉴定
由图２可知，提取微藻总ＤＮＡ，利用特异性引物，ＰＣＲ扩增获得微藻１８Ｓ ｒＤＮＡ片段，大小约７５０ ｂｐ。对ＰＣＲ产物进行序列测定，在ＮＣＢＩ中进行ＢＬＡＳＴ同源性分析，并构建系统发育树。
由图３可知，ＢＱ１与Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ １８Ｓ ｒＲＮＡ 基因同源性为９０％。ＢＱ２与Ｃ． ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ １８Ｓ ｒＲＮＡ基因同源性为９０％。ＢＱ３与Ｃ． ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ １８Ｓ ｒＲＮＡ基因同源性为９０％。ＢＱ５与Ｃ． ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ １８Ｓ ｒＲＮＡ基因同源性为９０％。ＢＱ６与Ｃ． ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ １８Ｓ ｒＲＮＡ基因同源性为９０％。Ｈ２－２与Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＣＣＡＰ ２６０/１１ １８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ基因同源性为９６％。ＱＳ１与Ｃ． ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ １８Ｓ ｒＲＮＡ基因同源性为９０％。ＱＳ２与Ｃ． ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ １８Ｓ ｒＲＮＡ基因同源性为９０％。Ｈ２－１与Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ ｅｈｒｅｎｂｅｒｇｉａｎｕｍ ｓｔｒａｉｎ １８Ｓ ｒＲＮＡ基因同源性为８７％。
综合序列比对、系统进化树、显微形态等结果，初步确定ＱＳ１、ＱＳ２、ＱＳ３、ＢＱ１、ＢＱ２、ＢＱ３、ＢＱ４、ＢＱ５、ＢＱ６、Ｈ１－１、Ｈ２－２均属于小球藻属，Ｈ２－１属于胶网藻属。
３讨论
分离鉴定结果表明，在武汉南湖水、青岛海水中小球藻分布较多，小球藻为这两个水域的优势藻种。分离的１１株小球藻与文献所报道的小球藻的油脂含量一般在１５％～５５％范围内的研究结果较一致。其中，小球藻Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＢＱ６油脂含量高、生长迅速，可作为进一步发展生物能源的优良藻种。研究表明，小球藻可在光照下自养生长，也可在无光照条件下异养培养，通过优化其异养生长的条件，可获得高油脂含量［１２，１３］。小球藻是一种球形或椭球形单细胞绿藻，细胞大小约２～１２ μｍ，广泛分布于各种生境，特别是淡水环境中，适应性强、可进行大规模培养，细胞中含有的短链脂肪酸与柴油中脂肪酸相近，是一种优质的生物柴油原料。徐进等［１４］分离到多株油脂含量高的小球藻，Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＮＭＸ３７Ｎ的藻细胞中总脂含量可达到３３％左右。韦志勇等［１5］从７株小球藻中筛选到１株油脂产率较高的普通小球藻Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｎｏ． １，油脂含量和油脂产率分别为２３．７１％和０．２０６ ｇ／Ｌ。
利用微藻制备绿色能源具有广阔的前景。为了获得商业化生产，许多与脂类合成途径及油脂调控相关的基础生物学问题需要解决。如有效控制藻类的生长、脂类代谢，实现工业上大规模培养及下游加工技术的突破。可从以下几个方面进行改进：①通过基因工程和优化微藻的培养条件而进一步提高微藻的油脂含量和生物量；②提高工业上采用的微藻生物反应器的效率；③提取微藻细胞中的蛋白、碳水化合物等其他营养成分，开发更多的产品。本研究筛选出了高油脂含量的小球藻，后期研究中可进一步利用基因工程技术对富油微藻进行遗传改良，进一步提高微藻的油脂含量，为中国生物能源的生产和开发提供优良的藻种资源。
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