赵喜亭１，２，３，李艳楠１，蒋丽微１，马 林１，王会珍１，李明军１，２，３
（１．河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 ４５３００７；２．河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心，河南 新乡 ４５３００７；３．绿色药材生物技术河南省工程实验室，河南 新乡 ４５３００７）
摘要：以铁棍山药（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｏｐｐｏｓｉｔａ Ｔｈｕｎｂ． ｃｖ． Ｔｉｅｇｕｎ）为试材，采用分光光度法研究了其与褐变相关的山药苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）的特性以及不同抑制剂对ＰＡＬ活力的影响。结果表明，在试验范围内铁棍山药ＰＡＬ的最适ｐＨ为８．６，不耐碱，更不耐酸；最适温度为５０ ℃，有一定的高温耐受性，即使在８０ ℃条件下保温３０ ｍｉｎ仍有约１２％的活力残存；Ｌ－半胱氨酸盐酸盐和柠檬酸对铁棍山药ＰＡＬ活力具有明显抑制作用，植酸对ＰＡＬ的抑制作用不明显，而氯化钠能促进ＰＡＬ活力。为有效抑制ＰＡＬ引起的鲜切铁棍山药片的褐变，应在酸性（ｐＨ＜２．０）、低温（＜２０ ℃）或高温（＞８０ ℃）条件下进行山药切片的加工和贮藏，鲜切片的无硫护色剂应首选Ｌ－半胱氨酸盐酸盐，其次是柠檬酸。
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关键词 ：铁棍山药（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｏｐｐｏｓｉｔａ Ｔｈｕｎｂ． ｃｖ． Ｔｉｅｇｕｎ）；苯丙氨酸解氨酶（PAL）；特性；褐变抑制
中图分类号：Ｒ２８２．４文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1169-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.036
收稿日期：２０１４－０７－２９
基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项子课题（２００９ＺＸ０９３０８－００２）；河南省重点科技攻关项目（１１２１０２２１０３００）；
河南省教育厅自然科学基金项目（２０１０Ａ１８００１５；２０１０Ｂ３６０００２）
作者简介：赵喜亭（１９７１－），女，河南洛阳人，副教授，博士，主要从事药用植物生物技术研究，（电话）０３７３－３３２６３４０（电子信箱）ｚｈａｏｘｔ０４１１＠１２６．ｃｏｍ。
怀山药（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｏｐｐｏｓｉｔａ Ｔｈｕｍｂ）是我国著名的“四大怀药”之一，铁棍山药（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｏｐｐｏｓｉｔａ Ｔｈｕｎｂ． ｃｖ． Ｔｉｅｇｕｎ）是怀山药中的一个优良品种，具有很高的药用价值和食用价值，是滋补佳品［１］，深受人们喜爱。目前，国内对铁棍山药的开发研究主要集中在深加工方面，将铁棍山药加工为饮片是一种防止块茎腐烂变质、延长贮藏期、提高产品附加值的有效途径，但在加工过程中，鲜切片褐变与否是决定其品质好坏的关键因素。研究表明，铁棍山药的褐变分为酶促褐变和非酶促褐变两种，而酶促褐变的褐变度与铁棍山药多酚氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）、过氧化物酶（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ）和苯丙氨酸解氨酶（Ｐｈｅｎｙｌａｌｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅ，ＰＡＬ）活力呈正相关，其相关性大小为ＰＰＯ＞ＰＯＤ＞ＰＡＬ［２］，另有研究证明，ＰＡＬ与酚的生成有关，表明了其与褐变的关系密切［３］。目前，对铁棍山药ＰＰＯ［４，５］和ＰＯＤ［６］已经有了较为透彻的研究，为了全面有效地控制酶促褐变，对铁棍山药ＰＡＬ进行深入全面的研究具有重要意义。
ＰＡＬ是一种只存在于植物及微生物细胞内的酶，它是连接生物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，也是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶［７］，且ＰＡＬ的活力往往作为酚类褐变的指标，它可通过催化植物体内的次生代谢产物酚类物质的产生而影响酶促褐变［８］。从２００６年开始，河南师范大学四大怀药研究室就铁棍山药切片防褐护色展开了系列研究。本研究对铁棍山药片的ＰＡＬ特性及抑制剂对其活力的影响进行分析，为全面有效抑制鲜切铁棍山药片的褐变提供理论支持。
１ 材料与方法
１．１ 材料与试剂
供试铁棍山药由河南省温县农业科学研究所提供，收获后挑选大小一致、粗细均匀、无创伤、无病虫害的铁棍山药块茎切分成２ ｍｍ左右的薄片，备用。
Ｌ－苯丙氨酸、Ｌ－半胱氨酸盐酸盐、Ｌ－抗坏血酸、氯化钠、柠檬酸、ＥＤＴＡ－２Ｎａ、植酸均为分析纯。
１．２ 方法
１．２．１ ＰＡＬ活力测定 参照Ｋｏｕｋｏｌ等［９］的方法，有所改进。取０．６ ｇ铁棍山药切片，加入３ ｍＬ ２００ ｍｍｏｌ／Ｌ 的硼酸缓冲液ｐＨ ８．７冰浴条件下充分研磨，然后于４ ℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ下离心２０ ｍｉｎ，收集上清液并立即用于酶活测定。ＰＡＬ酶活反应体系为： ２ ｍＬ ２００ ｍｍｏｌ／Ｌ 的硼酸缓冲液ｐＨ ８．７、２００ μＬ粗酶提取液和１ ｍＬ ２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－苯丙氨酸。将该反应体系于３０ ℃下保温３０ ｍｉｎ后，测定其在２９０ ｎｍ波长处的吸光度。１个酶活力单位（Ｕ）定义为测定条件下每分钟引起Ａ２９０ ｎｍ变化０．０１所需的酶量。
１．２．２ ｐＨ对铁棍山药ＰAL活力的影响
１）最适ｐＨ。配制０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ分别为７．０、８．０、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２的硼酸缓冲液。建立反应体系，以Ｌ－苯丙氨酸为底物，３０ ℃水浴条件下分别测定ＰＡＬ活力。
２）酸碱耐受性。将加入底物的酶液在０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ为２的柠檬酸缓冲液和ｐＨ为８的硼酸缓冲液中，于３０ ℃水浴依次保温0、５、１０、２０、３０、６０ ｍｉｎ后，测定ＰＡＬ活力。
１．２．３ 温度对铁棍山药ＰAL活力的影响
１）最适温度。以最适ｐＨ的硼酸缓冲液按活力测定方法建立反应体系，分别于２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０ ℃下保温３０ ｍｉｎ，然后立即加入酶液测定ＰＡＬ活力。
２）温度耐受性。将加入底物的酶液置于２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ ℃水浴下分别保温０、５、１０、２０、３０ ｍｉｎ，测定ＰＡＬ活力。
１．２．４ 抑制剂对ＰＡＬ活力的影响 在反应混合液中分别加入柠檬酸、Ｌ－半胱氨酸盐酸盐、植酸、氯化钠，使其质量分数分别为０、０．２５％、０．５０％、１．００％、２．００％，在最适条件下测定ＰＡＬ活力。
２ 结果与分析
２．１ ｐＨ对铁棍山药ＰＡＬ活力的影响
２．１．１ 最适ｐＨ 由图１－Ａ可知，在ｐＨ ７．０～９．２范围内，铁棍山药ＰＡＬ活力呈先升后降的变化趋势，ｐＨ为８．６时，铁棍山药ＰＡＬ活力达最大。因此，为了控制铁棍山药酶促褐变，应避开ｐＨ ８．６的环境进行铁棍山药切片的鲜切加工。
２．１．２ 酸碱耐受性 由图１－Ｂ可知，在ｐＨ ２的柠檬酸缓冲液和ｐＨ ８的硼酸缓冲液中，随着保温时间的延长，铁棍山药ＰＡＬ活力先急速下降，然后缓慢升高。从整体上说，ｐＨ ８条件下的酶活力明显高于ｐＨ ２条件下的酶活力，这与铁棍山药ＰＡＬ活力最适ｐＨ较高的结果相一致。水浴保温５ ｍｉｎ时，ｐＨ ２和ｐＨ ８条件下，酶活力残存都小于５０％（图１－Ｂ），ｐＨ ２时，酶活力下降的更多更快。说明ＰＡＬ不耐酸碱，尤其不耐酸。因此，在进行切片护色时，ｐＨ较低的护色液比碱性护色液更能抑制铁棍山药切片ＰＡＬ的活力。
２．２ 温度对铁棍山药ＰＡＬ活力的影响
２．２．１ 最适温度 不同温度条件下铁棍山药ＰＡＬ的活力变化见图２－Ａ。由图２－Ａ可以看出，铁棍山药ＰＡＬ活力随温度变化呈现两个阶段。阶段Ⅰ为０～５０ ℃，ＰＡＬ的活力随温度升高而升高；阶段Ⅱ为５０～９０ ℃，ＰＡＬ活力随温度升高而降低，９０ ℃时达到最小值。因此，ＰＡＬ的最适温度为５０ ℃，在低温（＜２０ ℃）或高温（＞８０ ℃）条件下进行铁棍山药切片的加工可以有效抑制ＰＡＬ引起的酶促褐变的发生。
２．２．２ 温度耐受性 由图２－Ｂ可知，在２０～５０ ℃范围内，保温使铁棍山药ＰＡＬ活力降低不明显；２０ ℃保温３０ ｍｉｎ ＰＡＬ活力无明显降低，３０ ℃和４０ ℃保温３０ ｍｉｎ活力仅降低了１５个百分点左右，５０ ℃保温３０ ｍｉｎ活力降低了２０个百分点；高于５０ ℃之后，保温使ＰＡＬ活力迅速降低，但在６０ ℃条件下保温３０ ｍｉｎ，ＰＡＬ仍有约４５％的相对活力，即使在８０ ℃条件下保温３０ ｍｉｎ仍有约１２％的相对活力残存。以上说明，铁棍山药ＰＡＬ对高温有一定的耐受性，热稳定性较强。
２．３ 抑制剂对铁棍山药ＰＡＬ活力的影响
由图３可知，在质量分数０．２５％时，Ｌ－半胱氨酸盐酸盐、柠檬酸、植酸和氯化钠对铁棍山药ＰＡＬ活力均具有明显的抑制作用。在０．２５％～２．００％范围内，氯化钠对ＰＡＬ活力具有明显的促进作用，植酸对ＰＡＬ活力没有明显作用，Ｌ－半胱氨酸盐酸盐和柠檬酸对ＰＡＬ活力的抑制作用随其质量分数的升高而加强。由此可知，Ｌ－半胱氨酸盐酸盐、柠檬酸均能有效控制铁棍山药鲜切片ＰＡＬ的活力，尤其以Ｌ－半胱氨酸盐酸盐效果最佳。这说明抑制剂能够达到有效抑制ＰＡＬ引起的铁棍山药鲜切片褐变的目的。
３ 小结与讨论
本试验结果表明，铁棍山药ＰＡＬ反应的最适ｐＨ为８．６；ＰＡＬ的酸碱耐受性结果表明，ｐＨ为２的条件下酶活力普遍低于ｐＨ为８条件下的酶活力。这说明酸性护色液比碱性护色液更能抑制铁棍山药鲜切片ＰＡＬ的活力。这与甘薯（ｐＨ ８．５～９．５）［１０］、水稻（ｐＨ ９．２）［１１］、小麦（ｐＨ ８．８）［１１］、芦笋（ｐＨ ８．８）［１２］、茉莉叶片（ｐＨ ８．８）［１３］PAL的最适ｐＨ相同，与江力等［１４］对山药ＰＡＬ特性的研究中得到的两个最适ｐＨ ８．０、８．８也大致相同。江力等［１４］对山药ＰＡＬ的酸碱耐受性研究表明，保温２０ ｍｉｎ内，酸性条件下的ＰＡＬ活力更高，这与本研究结果相反，但是随保温时间延长，碱性条件下的ＰＡＬ活力更高，与本研究结果一致。
研究表明，不同植物ＰＡＬ的最适温度和对高温的耐受能力不同。芦笋ＰＡＬ的最适温度为６０ ℃，且在６０ ℃以上活力显著降低［１２］，茉莉叶片ＰＡＬ的最适反应温度为３５ ℃，超过３５ ℃其活力明显下降［１３］。本研究结果表明，铁棍山药ＰＡＬ最适温度为５０ ℃，其活力在较低温度（０～４０ ℃）下保持较高水平，在较高温度（５０～８０ ℃）下随温度升高活力下降。而江力等［１４］研究发现，当温度达到４５ ℃时山药ＰＡＬ活力最大，而且山药ＰＡＬ的反应适宜温度为３５～５５ ℃。出现这种差异可能与所选山药品种有关。
抑制褐变的措施之一是运用抗褐变剂抑制褐变相关的酶活。研究表明，抑制ＰＡＬ酶活的抗褐变剂主要包括有机小分子和金属离子两大类，有机小分子包括肉桂酸、８－香豆酸、Ｌ－２－氨氧基－３－苯丙酸、２－氨氧基乙酸以及某些氨基酸如组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、氟苯丙氨酸等［１１］。宛国伟等［１５］研究表明，不同浓度的苯丙氨酸、肉桂酸和阿魏酸溶液对离体丹参根的ＰＡＬ活力均有抑制作用。本研究结果表明，Ｌ－半胱氨酸盐酸盐对ＰＡＬ的抑制作用最为明显，其次是柠檬酸。植酸对ＰＡＬ的抑制作用不明显，其中Ｌ－半胱氨酸盐酸盐对ＰＡＬ的抑制作用与江力等［１４］的结果一致。金属离子如Ａｇ＋、Ｃｏ２＋、Ｃａ２＋等均可抑制百合鳞茎ＰＡＬ的活力，以Ａｇ＋的抑制作用最强；但一些金属离子Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋可能作为辅基与酶蛋白相互结合对百合鳞茎ＰＡＬ的活力有明显的促进作用；还有些离子对ＰＡＬ活力的作用与浓度有关，如Ｎａ＋随着浓度的升高，对ＰＡＬ的作用由抑制变为促进作用，Ｍｇ２＋随着浓度的升高对ＰＡＬ的作用由促进变为抑制［１６］。本研究也发现，Ｎａ＋浓度小于０．２５％时，明显抑制铁棍山药的ＰＡＬ活力，但当Ｎａ＋浓度在０．２５％～２．００％范围内时，对ＰＡＬ的活力具有明显的促进作用。
综合以上分析可知，为了有效抑制ＰＡＬ引起的鲜切铁棍山药片的褐变，应在酸性（ｐＨ＜２．０）、低温（＜２０ ℃）或高温（＞８０ ℃）条件下进行山药切片的加工和贮藏，鲜切的无硫护色剂应首先选择Ｌ－半胱氨酸盐酸盐，其次是柠檬酸。
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（责任编辑 赵 娟）