程爱芳，邓政东，黄芳一，陈 文，周念波
（武汉生物工程学院生命科学与技术学院，武汉 ４３０４１５）
摘要：采用ＤＮＳ比色法，通过单因素试验和正交试验对多黏芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＨＤ－１产β－甘露聚糖酶的培养基主要成分和培养条件进行优化。结果表明，该菌种产β－甘露聚糖酶的最适培养基为魔芋粉０．７５％、酵母膏１．００％、磷酸二氢钾０．０４％、硫酸镁０．０５％，培养基初始ｐＨ ９．０；最适培养条件为接种量６％，培养温度３１ ℃，培养时间２７ ｈ。在此优化条件下，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶活性可达７２．６ Ｕ／ｍＬ。
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关键词 ：多黏芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）；β－甘露聚糖酶；发酵条件；优化
中图分类号：Ｑ９３９．９７文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）01－0164-04
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０42
Ｏｐｔｉｍｉｚing Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Producing ｔｈｅ β-mａｎｎａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＨＤ－１
ＣＨＥＮＧ Ａｉ－ｆａｎｇ，ＤＥＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｄｏｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｆａｎｇ－ｙｉ，CHEN Wen，ＺＨＯＵ Ｎｉａｎ－ｂｏ
（School of Life science and Technology，Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ of Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ ４３０４１５， Ｃｈｉｎａ ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＳ， ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ used ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＨＤ－１ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ β－ｍａｎｎａｎａｓｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍal ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ０．７５％ ｋｏｎｊａｃ，１．００％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０．０４％ ＫＨ２ＰＯ４·３Ｈ２Ｏ， ０．０５％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ９．０． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍal ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ６％ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ， ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ of ３１ ℃， ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｌｅｎｇｔｈ ２７ of ｈｏｕｒｓ． Ｕｎｄｅｒ these ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ β－ｍａｎｎａｎａｓｅ produced ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＨＤ－１ was ７２．６ Ｕ／ｍＬ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ； β－ｍａｎｎａｎａｓｅ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
收稿日期：２０１４－０９－１６
基金项目：武汉生物工程学院校级研究项目（２０１３ＪＹＩ０１）
作者简介：程爱芳（１９８０－），女，湖北武汉人，硕士，讲师，主要从事微生物发酵方面的研究，（电话）１５３２７１６４５８２（电子信箱）ｃａｆ２００２＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
β－甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β－甘露聚糖等［１－３］。β－甘露聚糖酶可以用于饲料工业，能消除甘露聚糖对单胃动物各种营养素的抗营养作用［４－６］，还可用于糖链结构的分析、造纸业、纺织业、石油业等。微生物是产生β－甘露聚糖酶的主要来源，且具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点［７，８］。本试验以多黏芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）为生产菌株，通过单因素试验和正交试验［９，１０］对多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的培养基成分和培养条件进行优化，以提高其产酶活力，为后续的开发利用奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌种 多黏芽孢杆菌突变菌株ＨＤ－１，由武汉生物工程学院发酵工程实验室保藏。
１．１．２ 培养基 斜面活化培养基：３ ｇ／Ｌ牛肉膏、１０ ｇ／Ｌ蛋白胨、５ ｇ／Ｌ氯化钠、２０ ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ ７．４；液体种子培养基：５ ｇ／Ｌ魔芋粉、１０ ｇ／Ｌ酵母膏、１ｇ／Ｌ硫酸镁、０．５ ｇ／Ｌ磷酸二氢钾、１ ｇ／Ｌ硫酸铵，ｐＨ ７．５；基础产酶培养基：５ ｇ／Ｌ魔芋粉、１０ ｇ／Ｌ蛋白胨、０．２ ｇ／Ｌ磷酸二氫钾、０．５ ｇ／Ｌ硫酸镁，ｐＨ ８．０。
１．２ 方法
１．２．１ 粗酶液的制备 将保存的多黏芽孢杆菌ＨＤ－１接种于斜面活化培养基上，３５ ℃活化培养２４ ｈ。取一环活化后的菌种ＨＤ－１，接入装有５０ ｍＬ液体种子培养基的２５０ ｍＬ三角瓶中，２００ ｒ／ｍｉｎ、３５ ℃恒温培养２４ ｈ。以４ ％接种量将液体种子接入盛有５０ ｍＬ基础产酶培养基的２５０ ｍＬ三角瓶中，２００ ｒ／ｍｉｎ、３５ ℃恒温摇床振荡培养２４ ｈ。将培养了２４ ｈ的发酵液５ ０００ ｒ／ｍｉｎ冷冻离心５ ｍｉｎ，取上清液即为粗酶液，４ ℃保存备用。
１．２．２ 甘露聚糖酶活性的测定 以酶活为指标，以魔芋胶为底物，采用ＤＮＳ比色法测定发酵液中甘露聚糖酶的活性［７］。在上述条件下，每分钟由底物释放出相当于１ μｍｏｌ Ｄ－甘露糖的还原糖所需的酶量为１个酶活力单位（Ｕ）。
１．２．３ 菌种产酶条件的单因素试验 以基础产酶培养基为基础，研究不同碳源、氮源、培养温度、培养基初始ｐＨ、摇床转速、接种量、装液量、发酵时间对多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的影响。
１．２．４ 正交试验优化产酶培养基 根据单因素试验结果，取对培养基影响较大的４个因素魔芋粉、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁，每因素取３个水平，采用Ｌ９（３４）正交试验优化产酶培养基。试验因素及水平见表１。
１．２．５ 正交试验优化培养条件 根据单因素试验结果，取对培养条件影响较大的４个因素培养温度、培养基初始ｐＨ、接种量、发酵时间，每因素取３个水平，采用Ｌ９（３４）正交试验优化产酶培养条件。试验因素及水平见表２。
２ 结果与分析
２．１ 单因素试验结果
２．１．１ 不同碳源对发酵产酶的影响 选取６种碳源进行多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的培养，结果如图１所示，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的最适碳源为魔芋粉。在确定魔芋粉为最适碳源后，对其用量进行试验，结果如图２所示，魔芋粉的用量在０．２５％至１．０0％时，β－甘露聚糖酶活力较高，０．７５％时达到最高，超过１．０0％后，酶活力迅速下降，因为魔芋胶为粘多糖，浓度太高影响培养基的流动性和溶氧量，不利于产酶。
２．１．２ 不同氮源对发酵产酶的影响 选取６种氮源进行多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的培养，结果如图３所示，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的最适氮源为酵母膏。在确定酵母膏为最适氮源后，对其用量进行试验，结果如图４所示，酵母膏用量在０．２５％至１．０0％时，β－甘露聚糖酶活力不断升高，１．０0％时达到最高，超过１．０0％后，酶活迅速下降。
２．１．３ 培养基初始ｐＨ对发酵产酶的影响 不同菌株发酵的最适培养基初始ｐＨ相差较大，本试验设定８个ｐＨ梯度进行多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的培养，结果如图５所示，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的最适初始ｐＨ为９．０。
２．１．４ 装液量对发酵产酶的影响 装液量的多少影响发酵过程中的通气及溶氧情况从而影响产酶。不同装液量对多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的影响结果如图６所示。由图６可知，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的摇瓶发酵最适装液量为５０ ｍＬ/250 mL。
２．１．５ 接种量对发酵产酶的影响 接种量对发酵产酶的影响结果如图７所示，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的最适接种量为６％，因为过大的接种量引起短时间内菌体大量生长繁殖，从而使溶氧不足，不利于产酶。
２．１．６ 培养温度对发酵产酶的影响 温度对多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的影响结果如图８所示，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的最适培养温度为３３ ℃，超过３３ ℃菌体提前衰老，酶活迅速下降。
２．１．７ 摇床转速对发酵产酶的影响 摇床转速对多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的影响结果如图９所示，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的最适摇床转速为２４０ ｒ／ｍｉｎ。转速太小，影响通气量，不利于产酶；转速太大，气体停留时间缩短从而使得溶氧量减低，同时剪切力过大，不利于产酶。
２．１．８ 发酵时间对发酵产酶的影响 发酵时间对多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的影响结果如图１０所示，多黏芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的最适发酵时间为３０～４８ ｈ。发酵时间过短，微生物没有充分生长，时间过长，微生物发生自溶，均不利于产酶。
２．２ 正交试验结果
２．２．１ 培养基成分正交试验结果 由表３可知，影响多黏芽孢杆菌ＨＤ－１产β－甘露聚糖酶的培养基成分因素由大到小顺序为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，优化组合为Ａ２Ｂ２Ｃ３Ｄ１，即魔芋粉０．７５％、酵母膏１．００％、磷酸二氢钾０．０４％、硫酸镁０．０５％。
２．２．２ 培养条件正交试验结果 由表４可知，影响多黏芽孢杆菌ＨＤ－１产β－甘露聚糖酶的培养条件因素由大到小顺序为Ｈ、Ｅ、Ｇ、Ｆ，最优组合为Ｅ１Ｆ３Ｇ２Ｈ２，即培养温度３１ ℃、初始ｐＨ ９．０、接种量６％、发酵时间２７ ｈ。
３ 小结
通过单因素和正交试验对多黏芽孢杆菌ＨＤ－１的培养基成分和培养条件进行了优化，得到其产β－甘露聚糖酶的最优发酵条件为魔芋粉０．７５％、酵母膏１．００％、磷酸二氢钾０．０４％、硫酸镁０．０５％、培养基初始ｐＨ ９．０，培养温度３１ ℃、接种量６％、发酵时间２７ ｈ。在此条件下，β－甘露聚糖酶活力可达７２．６ Ｕ／ｍＬ。另外，从２个正交试验结果可以看出，魔芋粉用量、酵母膏用量、培养温度和发酵时间对产酶影响较大，严格控制有利于产酶。
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（责任编辑 赵 娟）