李庆军1,2，杨小芹3，梁丽霞4，王洪涛4，刘成连2，原永兵2
（1黄河三角洲（滨州）国家农业科技园区管委会，山东滨州256600；2青岛农业大学/青岛市现代农业质量与安全工程实验室，山东青岛266109；3桓台县林业局，山东淄博256400；4无棣县林业局，山东滨州256600）
摘要：为了探明冬枣青斑病的发病原因以便有针对性地确定防治方案，笔者在实验室提纯、回接了病斑处微生物，在枣园观察发病情况并进行施肥和喷药防治。结果表明，通过对病斑处进行微生物培养、纯化、回接，发现从病班处分离的链格孢菌回接冬枣上不会主动侵染，刺孔培养后也不会形成青斑。因此，冬枣青斑病不是真菌等微生物直接侵染引起。通过观察病斑在树冠和果实上的位置，发现青斑在树冠内堂发病率最高，为22.23%；青斑主要发生在果实的背阴面，占所采病果的51.73%；主要发生在果实的中部，占所采病果的41.38%，由此可初步断定冬枣青斑病可能是缺钙引起；架设防虫网架并喷杀虫剂后，发病率显著高于对照和其他处理，而杀菌、喷钙后发病率显著降低对照，说明冬枣青斑病也不是昆虫叮咬引起，而是由于冬枣缺钙等微量元素导致冬枣抵御真菌侵染的能力下降，链格孢菌通过机械损伤或昆虫叮咬的伤口侵染所致。
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关键词 ：冬枣；青斑病；病因
中图分类号：S665.1 文献标志码：A 论文编号：2014-0888
第一作者简介：李庆军，男，1980 年出生，山东莱芜人，硕士，主要从事果树栽培和果园生态研究。通信地址：256600 山东省滨州市滨城区凤祥名都22-404，E-mail：qingjunlee@126.com。
通讯作者：原永兵，男，1960 年出生，山东文登人，教授，博士，主要从事果树栽培和果实品质形成机理研究。通信地址：266109 青岛农业大学现代农业质量与安全工程实验室，Tel：0532-86080018，E-mail：yyb@qau.edu.cn。
收稿日期：2014-09-04，修回日期：2015-02-27。
0 引言
冬枣(Zizyphus jujube Mill vc. Dongzao)别名苹果枣、雁来红、冻枣、冰糖枣，是由普通枣变异而来[1]。冬枣含有19 种氨基酸，总含量为0.985 mg/100 g，含蛋白质1.65%，总黄酮0.026%、烟酸0.87 mg/100 g[2]，含维生素C最为丰富，达350~380 mg/100 g[3-4]，是苹果含量的70 倍[5]、梨的140 倍，是目前最高档的鲜食品种之一[6]。随着人民生活水平的提高，冬枣的营养价值和商品价值逐渐被发掘出来，近几年在环渤海地区发展迅速，目前在山东无棣、沾化，河北黄骅一带种植面积已经超过百万亩，成为当地的农业支柱产业[7]。2008 年滨州市部分枣产区发生冬枣青斑病。发病初期，呈圆形或近圆形凹陷淡绿色病斑，后发展呈不规则条形，常并伴有0.5 mm左右突起和褐色圆形小病斑。感病后枣果即失去商品价值。2009 年，仅无棣县因青斑病造成的直接经济损失就达4.8 亿元，严重影响了农民收入，挫伤了枣农的生产积极性，阻碍了冬枣产业的持续健康发展。2010 年8 月5 日在无棣县部分枣园出现病情，比2009 年发病早12 天，并有发病更早、范围更大、危害更重的趋势。2011 年和2012 年病情扩展到无棣县和沾化县的大多数冬枣栽培区。因此，确定冬枣青斑病病因进而制定科学的治疗措施已迫在眉睫。
刘国利等[8]通过喷施代森锰锌、黎芦碱等有效控制了冬枣青斑病的发生，但对致病原因未作深入系统研究；吕景海等[9]认为，冬枣青斑病是因缺钙硼、过量使用激素、偏施N肥、虫害危害、环剥过度、土壤缺钾、病原微生物侵染等多种原因所致。但是，未明确哪一种因素是主要原因。因此，本研究从分离回接冬枣青斑病病菌、分析病果分布规律和喷药施肥入手，初步探明了该病发生的根本原因、并发症状和防治措施。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
套袋发病情况调查试验和青斑发生位置、部位田间调查试验于2011 年9 月18 日在无棣县舜园枣业有限公司枣园进行。
喷施农药和叶面肥试验于2012 年5 月至9 月进行，试验园设在海丰办事处冯铺村冬枣示范园（1 号园）、棣丰办事处杨白杨冬枣示范园（2 号园）和小泊头镇丁王庄示范园（3 号园）。
1.2 试验材料
试验园所栽品种均为‘鲁北冬枣’，树龄15 年以上，树势健壮，2009—2011 年都有青斑病发生。用于病原培养的枣果和健康果均于2011 年8 月13 日和8 月26 日2 次均采自无棣县水湾镇鞠家村冬枣园，共计67个枣果样品。本园采取常规管理，2009 年、2010 年青斑病病情严重。
1.3 试验方法
1.3.1 试验设计分2 批共随机摘取67个无机械损伤病果进行病原菌的分离、纯化和回接试验。（1）调查青斑果实在树冠上的分布时，每10 株树1 组，3 个重复，随机取组设计，分别观察枣树内膛、树冠外围的南侧和北侧随机观察20 个果实的发病率[10-11]。（2）调查青斑在果实上的分布时，每组随机摘取100 个病果，共3 组，统计病斑部位[12]。防虫、杀菌和喷施钙肥试验设防虫、杀菌杀虫和施钙肥3 个处理，以常规管理为对照，每处理10株树，3 个重复，随机取组设计。
1.3.2 病原培养从发病果实样品中随机取出已发病但表皮未损伤的枣果，取病健交界处切成直径约5 mm的小组织块装入培养血内，每果取4 块。在超净工作台内先用75%的酒精将组织块进行表面消毒约10 s，然后用1%的次氯酸钠浸泡0.5 min，最后用无菌水冲洗3 次。用在酒精灯上灭过菌的镊子将组织块取出，放在PDA平板上，每皿放4 块，置于25℃恒温培养箱中培养，5 天后检查记录培养结果。培养物分别以菌1、菌2、菌3……表示。转管保存于4℃冰箱中待用[13]。
1.3.3 病原菌的纯化，筛选将单孢分离纯化的菌株，置于PDA培养基上使其产孢，观察菌株培养性状，镜检孢子形态特征、测量孢子大小，初步鉴定到属或种。
1.3.4 病原菌致病性测定用70%酒精棉球将枣果表面消毒，打孔器打取直径5 mm的病原菌菌片，分别贴于枣果表面，每果接种2 个位点，分针尖刺伤和无刺伤2种处理，每处理3 个果实，保湿48 h，以无菌水作对照。接种后枣果在28℃下保湿培养，5 天后统计发病率[14-15]。
1.3.4 防虫、施用钙素和杀虫杀菌试验试验设防虫、杀菌和施钙肥3 个处理，以常规管理为对照，每处理10株树，3 个重复，随机取组设计。防虫试验于枣树开甲后每10 株树罩1 个防虫网架，并于2011 年4 月中旬—9月上旬每15 天喷1 次30%吡虫啉3000 倍；杀菌试验从4 月中旬—9 月上旬每15 天喷1 次大生M-45 加300 万单位农用链霉素；施钙肥从4 月上旬—9 月上旬每15天喷1 次氨基态页面钙肥。
9 月下旬按东西南北中每棵树取样调查100 个果，统计计算病果率。
1.3.5 统计分析用DPS 7.0 进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 病原菌的分离、纯化
经培养，青斑病样品2 批67 个病果分离获得2 种分离物。一种分离物在PDA 培养基上呈绒状，灰褐色至黑色。菌丝匍匐于基质表面，分生孢子梗单生或成簇，大多数不分枝，分隔，较短，褐绿色至暗色。分生孢子倒棒形或卵形，单个或成串着生于孢梗的顶端，大小极不规律，褐绿色、褐黑色至暗色。另一种分离物为白色，在培养基上呈绒状，5~7 天后颜色逐渐变深变褐。
2.2 病原菌回接试验
接种处理，1 组为空白对照（滤纸沾无菌水后贴果皮表面）；2 组回接白菌，3 组、4 组回接褐菌，5 组为病果对照。
空白对照的刺孔和不刺孔处理中各果均无感病症状；2 组回接白菌的刺孔处理三果在刺孔处均有浅褐色病斑，但与自然发病的典型症状相比差异较大。不刺孔三果均无感病症状；3、4 组回接褐菌的6 个刺孔果在刺孔处有褐色至黑色病斑，与自然发病的青斑上的褐色小斑点症状吻合。取病果进行再分离，镜检证实为接种菌。经显微形态观察，确定引发冬枣青斑处褐色小点的病源为半知菌亚门的链格孢菌(Alternaria)。
各处理均未出现青斑，可见病斑不是真菌引起的。不刺孔各处理均未染菌感病，说明链格孢菌为腐生性真菌，主动侵染性差。
2.3 青斑果实在树冠上的分布
青斑果实在树冠上的分布情况如图1 所示。主要发生在树冠内堂，发病率为22.23% ，而外围仅为2.27%，其中外围南侧发病率1.31%，外围北侧发病率3%。结果表明，树冠内堂发病率明显高于外围，外围北侧又高于外围南侧。这可能与树冠外围，特别是外围南侧通风[16]透光较好，蒸腾拉力强有关[17]。
2.4 青斑在果实上的分布
青斑在果实上的分布情况如图2 和图3 所示。从横向看（见图2），青斑主要发生在果实的背阴面，占所采病果的55%，其次为侧面占31%，阳面最少占14%；从纵向看（见图3），青斑主要发生在果实的中部，占所采病果的45.67%，其次为中上部和中下部，分别占20.67% 和21.67% 。果实底部发病果占总病果的6.3%。果实顶部无发病现象。结果表明，果实向阳面发病轻，背阴面发病重。可见青斑病与光照、果实表面蒸腾拉力有关。有研究表明[18]，无论在果实生长的哪个时期，果肩处的钙含量最多，果实中部最少。这与枣青斑在果实上的分布情况相一致。此结果表明，低水平的钙含量可能是青斑发生的一个重要因素。
2.5 防虫、杀菌和喷施钙肥试验
防虫处理的发病率显著高于对照和其他处理。可见单独防虫不仅不能防治冬枣青斑病，反而使病情更加严重。喷施钙肥和喷杀菌剂都能有效控制发病，说明该病不是昆虫叮咬所致而与缺钙、真菌腐生有关[19]。这和刘国利等[8]的研究结果是一致的。架设防虫网架可使空气湿度增加，果面蒸腾受阻，妨碍了钙等微量元素的运输吸收，为真菌的滋生蔓延创造了适宜的环境条件。
3 讨论
真菌回接试验过程中所分离出的链格孢菌不具有主动侵染性，刺孔侵染后也没有出现青斑，只有褐色圆形病斑[20]。这说明冬枣青斑病不是真菌直接侵染引起。通过防虫、杀菌、喷施钙肥试验，表明冬枣青斑病也不是昆虫叮咬引起的。而是由于冬枣缺钙等微量元素导致冬枣抵御真菌侵染的能力下降，链格孢菌通过机械损伤或昆虫叮咬的伤口侵染所致。
钙是细胞膜的结构物质[21-22]。钙与磷脂和蛋白质结合影响膜的相变和流动性[23]，并有利于维持膜的稳定性[24]。果实生理失调可能是由于膜功能损伤，引起代谢的分室作用遭到破坏所致[25]。因为：（1）白熟期发病。白熟期就是果实膨大期，这个时候果实生长很快，如果吸收不到足够的微量元素，就容易表现出缺素症。（2）病斑发生在背阴、蒸腾拉力弱的部位。蒸腾拉力越小越不利于微量元素的运输、吸收。（3）叶片越绿的树上发病越明显。这是微量元素在营养生长和生殖生长过程中的分布矛盾问题。叶片越强势，吸收养分的能力就越强，争夺了本该果实吸收的营养，故病情越严重。
要根除青斑病就要从地下到地上，从枣树发芽到结果落叶，进行全方位、全时段防治。（1）补充微量元素，均衡树体营养，增强枣树抗病能力。施基肥时每公顷施45~75 kg 硝酸钙。在不影响果面光洁度的前提下适当喷施含钙叶面肥；（2）及时杀菌，防止病菌滋生。可选用大生M-45，石硫合剂，农用链霉素等；（3）选择吡虫啉、甲维盐等杀虫剂防治虫害，防止果面机械损伤。
4 结论
虽然喷施杀菌剂能降低冬枣青斑病发病率，但链格孢菌回接时侵染症状与青斑病不同，说明真菌不是致病的根本原因。喷施叶面钙肥可显著降低发病率，因此缺钙可能是冬枣青斑病发生的根本原因。缺钙导致果实抵御病菌侵染的能力下降，加上机械损伤等因素共同导致了青斑病的发生。
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