边传红1，王伟杰2，赵世民3，康业斌1
（1河南科技大学林学院，河南洛阳471003；2洛阳市烟草公司嵩县支公司，河南嵩县471400；3河南省烟草公司洛阳市公司，河南洛阳471023）
摘要：从河南省嵩县送检的烟草茎黑腐病样本上分离获得1 株腐霉菌，为明确该菌的种类及对烟草的致病力，对所得菌株进行形态学鉴定、DNA序列分析和致病性测定。结果表明，菌株菌落呈放射状型，并逐渐变为花瓣型，菌丝无隔；孢子囊球形、梨形；藏卵器球形；雄器钟状或不规则；rDNA-ITS 序列测定分析，该菌序列与GenBank上登录号KC014615.1 和GU133597.1 等的序列同源性大于99%，鉴定为钟器腐霉(Pythium vexans de Bary)。对培育到10 叶期的‘中烟100’品种接种，7 天后该菌的病情指数为48，对照瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的病情指数为62.7，表明其对‘中烟100’的致病力不及瓜果腐霉。
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关键词 ：烟草；钟器腐霉；rDNA-ITS；致病性测定
中图分类号：S432.4 文献标志码：A 论文编号：2014-0479
Molecular Identification and Pathogenicity of Pythium vexans Isolated from Tobacco
Bian Chuanhong1, Wang Weijie2, Zhao Shimin3, Kang Yebin1
(1College of Forestry, Henan University of science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China;2Songxian Branch Company of Luoyang Tobacco Company, Songxian 471400, Henan, China;3Luoyang Tobacco Company of Henan Tobacco Company, Luoyang 471023, Henan, China)
Abstract:Pythium was isolated from tobacco stems back rot samples in Song County of Henan Province. Inorder to know its classification and pathogenicity to tobacco, the morphologic characters that based onmicroscopy technology were examined and recorded, the rDNA- ITS sequences were analyzed, thepathogenicity tests were conducted. The results showed that the colonies were actinomorphic and graduallygrow into petaliform; hyphas were without separate; sporangiums were spherical or pear-shaped; archegoniumswere spherical; antheridiums are bell-shaped or irregular. According to the results of the analysis of rDNAITSsequences, the sequence homology was more than 99% when it was compared with the sequence ofregistration number kc014615.1 and gu133597 in GenBank. Therefore, the pathogen was identified asPythiumvexans de Bary. Seedings in ten leaf stage of‘Zhongyan 100’tobacco variety were inoculated withP. vexansde Bary, and the disease symptoms and the disease indexes were surveyed and recorded in the 7th day, thedisease index ofPythium vexans was 48 and theP. aphanidermatum was 62.7, the results indicated that thepathogenity ofPythium vexans was less thanP. aphanidermatum.
Key words: Tobacco;Pythium vexans ; rDNA-ITS; Pathogenicity
0 引言
腐霉(Pythium)是一种土壤习居菌，引起烟草苗期猝倒病或成株期茎黑腐病，在国内各产烟区均有分布[1]。国内目前报道侵染烟草的腐霉有瓜果腐霉(P.aphanidermatum)、德巴利腐霉(P. Debaryanum)、终极腐霉(P. ultimum)、畸雄腐霉(P. irregulare)[2]、异丝腐霉(P. diclinum)[3]共5 种。2011 年7 月，河南省嵩县烟草公司送检的‘中烟100’烟草病株，在茎的近土面处产生褐色水渍伤痕，主根与支根出现褐色病斑，严重者呈水渍状腐烂，病样采用组织分离法获得纯菌株，其分子鉴定及对烟草致病力的研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 病原菌的分离
用清水将发病烟株根茎部冲洗干净，吸水纸吸干组织表面水分，在超净工作台上用解剖刀将茎部病斑表层皮削去，再切取病、健交界处组织，置于盛有无菌水的灭菌培养皿中，剪成约5 mm×5 mm大小的组织块，并用无菌水清洗3 次，置于灭菌的滤纸上吸干水分后转接于加乳酸的PDA(1000:1)平板上，25℃黑暗条件下培养，待长出菌落后，挑取边缘菌丝接种于PDA平板上进行纯化，获得纯菌株。
1.2 形态学鉴定
参考Plaats-Niterink[4]和余永年[5]的方法，菌株在PDA培养基上养3~5 天后，用直径5 mm的打孔器打取菌饼，转接于CMA、OA培养基上，25℃黑暗条件下培养，7 天后观察菌落特征，在显微镜下观察并测量子实体大小。用十字交叉法测菌落直径，计算日生长速度[6]。
1.3 分子生物学鉴定
采用CTAB 法[7]提取腐霉菌的基因组DNA，利用通用引物ITS1 和ITS4 对其核糖体DNA-ITS 序列进行PCR 扩增。反应体系[8]：10 × PCR Buffer2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L 的引物1 μL，模板DNA 1 μL，5 U/μL Taq 聚合酶0.25 μL，用ddH2O 将反应体系补至25 μL。PCR 反应程序[12]：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，35 个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，紫外灯下检测扩增产物的有效性。检测到合适的条带后，将其所对应的原始扩增产物（未纯化）40 μL寄往上海生工测序。
1.4 致病力测定
1.4.1 烟苗培育方法将营养土（江西天慧牌烟草专用育苗基质与土壤等量混合）装入育苗托盘中铺平，将筛选好的‘中烟100’种子播下，每格1~3 粒，再覆盖1 层营养土，喷水至足够湿润但无积水，待子叶展开后减少喷水量，在烟苗长至十字期，将其移栽到10 cm×10 cm的营养钵中，室内每天12 h光照培育至10叶期备用[9-10]。1.4.2 接种方法腐霉菌在PDA 培养基上培养3~4 天后，用打孔器（直径7 mm）在菌落边缘打取菌碟，选取健康的长势一致的烟株，用解剖针在其茎基处刺8~10伤口，把菌碟贴在伤口处，并用湿脱脂棉球保湿固定，每个处理设15 个重复[11- 12]。以瓜果腐霉(P.aphanidermatum)菌株作对照。
1.4.3 观察记载‘中烟100’接种腐霉后24 h 黑暗处理，24 h 后室内12/12 光照培育，3~7 天内定期观察病害发生情况，根据植株茎部和叶片症状分级[13-14]，分级标准参照Shehata[15]的报道，略作修改。0 级—不发病；1 级—病斑小于植株茎围1/2，叶片不萎蔫；2 级—病斑小于植株茎围1/2，仅接种部位附近1~2 个叶片萎蔫；3级—病斑大于植株茎围1/2，萎蔫叶片数小于总叶片数的1/2；4 级—病斑大于植株茎围1/2，萎蔫叶片数大于总叶片数的1/2，但顶部1~2 片不萎蔫；5 级—病斑环绕植株茎围，全株萎蔫。
病情指数(DI)计算如式(1)[8-11]：式中：DI 为病情指数；Si为病级；ni为相应病株数；i=1、2、3···；N 为调查总株数。
DI＝Σ(Sini)/5N×100 …………………………… (1)
2 结果与分析
2.1 培养性状与形态特征
菌株在CMA、OA培养基上菌落呈圆型、白色、放射状，并逐渐变为花瓣型，边缘整齐，气生菌丝稀薄（图1），在CMA培养基上日生长速率为22 mm/d。在光学显微镜下观察菌丝直径约2.5~6.5 μm，平均直径约4.1 μm，菌丝无隔，非常发达且分枝繁茂；孢子囊顶生，多球形，少数梨形、袋形、卵圆形，直径约12.5~20.0 μm，平均直径约16.1 μm；藏卵器为球形，平滑，顶生，有时间生，直径约12.5~30.0 μm，平均约18.0 μm；雄器的形状有钟状、拳头状、粒状或不规则形，顶生，每一藏卵器有1~2 个雄器；卵孢子球形，光滑，大多不满器，少数满器，大小约13.8~25 μm，平均约18 μm，壁厚约0.6~2.5 μm，平均约1.4 μm。根据以上形态学特征，将其鉴定为腐霉属(Pythium sp.)。
2.2 核糖体DNA-ITS序列分析
对菌株进行rDNA-ITS 序列测定，获得有效序列长度609 bp，在GenBank 上进行BLAST 比对，使用Clustal_X (1.83)软件对自测序列以及从GenBank 下载的相关序列进行较准后，以距离法(neighbor-joining法)[16]利用MEGA6 软件[17]构建系统发育树（图2）。结果表明，该序列与登录号为KC014615.1 和GU133597.1 等的Pythium vexans（钟器腐霉）亲缘关系最近，rDNA-ITS序列同源性大于99%。
2.3 致病性测定
接种钟器腐霉菌1~2 天后，接种点病斑不明显，近接种点1~2 片叶萎蔫；3~4 天后1 株烟萎蔫，其余烟株病斑无扩展，但下部3~4 片叶萎蔫；接种5~6 天后病情无扩展；其中1 株1~2 天后接种点病斑水渍状，向上快速蔓延至生长点，大部分叶片萎垂。病情指数48。对照瓜果腐霉接种1~2 天后，接种点病斑不明显，近接种点1~2 片叶萎垂；3~4 天后有3 株烟苗萎蔫，其余烟株近接种点1~3 片叶枯萎，病斑无明显蔓延；接种5~6 天后3 株烟枯死，5 株烟病斑绕茎1 周但无明显蔓延，大部分叶片萎垂，其余烟株病斑无扩展；其中1 株接种1~2 天后接种点病斑水渍状并快速蔓延至生长点，叶片萎蔫，烟株枯死。病情指数为62.7（图3）。
3 结论
采用常规组织分离法获得的菌株在CMA、OA上培养，菌落呈放射型，并逐渐变为花瓣型；菌丝无隔膜；孢子囊多球形，顶生或间生；雄器钟状或不规则，顶生；藏卵器球形，平滑，多顶生；卵孢子球形，大多不满器。以上形态学特征与腐霉属(Pythium sp.)的特征相似。采用CTAB法提取菌株的基因组DNA，利用通用引物ITS1 和ITS4 对所提取的DNA 进行PCR 扩增，rDNA-ITS 序列测定，获得有效序列长度609 bp，在GenBank 上进行BLAST 比对，并利用MEGA6 软件以距离法构建系统发育树，从发育树可得出菌株与钟器腐霉(Pythium vexans de Bary)亲缘关系最近，rDNAITS序列同源性大于99%。根据菌株的形态特征及其rDNA-ITS 序列测定比对结果，参考国内外文献资料，将其鉴定为钟器腐霉(Pythium vexans de Bary)。采用钵栽‘中烟100’的10 叶期烟苗针刺接种进行致病力测定的结果表明，钟器腐霉的病情指数为48，瓜果腐霉侵染的病情指数为62.7，钟器腐霉的致病力弱于瓜果腐霉。
4 讨论
目前，世界已报到腐霉属有200 多种，具有致病性的有80 多种[18]。HO Hon-Hing[19]报道中国腐霉属有64 个种，其中大多数腐霉种对植物具有致病性，寄生植物的有44 个种。王家和[2]1994—1995 年分别从云南省11 个主要产烟区，采集根茎病害标样226 份，土壤标样60 份，分离纯化到42 个菌株，经致病性测定，侵染烟草的腐霉有瓜果腐霉(P. aphanidermatum)、德巴利腐霉(P. Debaryanum)、终极腐霉(P.ultimum)、畸雄腐霉(P. irregulare)，其中P.aphanidermatum 对烟草致病力最强，但对病原菌种类的鉴定仅依据形态学特征，缺乏分子生物学鉴定的支持。法国腐霉学者Paul 在20 年间利用形态特征和rDNA-ITS 序列分析发现10 多个腐霉新种[8]。本试验利用形态学及rDNA-ITS 序列分析相结合的方法鉴定病原菌，结果更真实可靠。
文献报道钟器腐霉对各种蔬菜、果木、茶叶、甘蔗、薯类、麦类等50 种以上经济植物都有致病性[20]，王宽仓[21]研究了钟器腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉、链状腐霉等7 种腐霉对13 种主要蔬菜和瓜类的致病性，结果表明终极腐霉、瓜果腐霉致病性最强，其次为链状腐霉，而钟器腐霉及其他腐霉对蔬菜的致病力较弱。Mulder[14]研究了与瓜果腐霉、间型腐霉、终极腐霉等几种腐霉对苹果幼苗的致病力，结果表明钟器腐霉对苹果幼苗的致病力弱，瓜果腐霉对苹果幼苗的致病力无致病力。笔者在室内人工条件下测定了钟器腐霉菌对河南省普遍种植的‘中烟100’烟草品种苗期的致病力，结果表明钟器腐霉的致病力弱于瓜果腐霉，至于该菌对其他烟草品种苗期的致病力以及烟草成株期的致病力有待进一步研究。
Shehata[15]在对烟草猝倒病病情调查时采用了5级分级标准，笔者在此基础上，结合中华人民共和国烟草行业标准——烟草病害分级及调查方法[22]，制订了苗期由腐霉菌侵染烟草引起的烟草猝倒病的6 级分级标准，可为该病害苗期病情调查及苗期接种试验作参考。
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参考文献
[1] 余永年.中国腐霉属的生态和分布[J].真菌学报,1987,6(1):20-33.
[2] 王家和.云南烤烟腐霉菌种类、分布及致病性研究[J].云南农业大学学报,1997,12(12):97-102.
[3] 劳超,刘云龙,谢勇,等.首次报道由异丝腐霉(Pythium diclinum)引起的烟草根腐病[J].云南农业大学学报,2012,21(6):905-909.
[4] Van der Plaats- Niterink A J. Monograph of the genus Pythium[J].Studies in Mycology,1981(21):1-242.
[5] 余永年.几种分离土壤腐霉的方法[J].微生物学通报,1975,2(2):26-31.[6] 余永年,马国忠,刘晓娟.腐霉属分类性状评价及其中国的种[J].真菌学报,1990(4):249-262.
[7] 吴发红,黄东益,黄小龙,等.几种真菌DNA 提取方法的比较[J].中国农学通报,2009,25(8):62-64.
[8] 李金花,柴兆祥.甘肃腐霉新记录种Pythium carolinianum 的分离鉴定及rDNA-ITS 序列分析[J].兰州大学学报:自然科学版,2010,6(46):84-95.
[9] 马京民,程兰,宋守晔,等.烟草漂浮育苗新技术[J].中国农学通报,2003,19(6):110-112.
[10] 姜洪甲,马维广,等.烟草育苗新型基质利用研究[J].安徽农业科学,2009,37(35):2054-2080.
[11] 方忠达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社,1998:11-65.
[12] Yannis Raftoyannis, Michael W Dick. Zoospore encystment andpathogenicity of Phytophthora and Pythium species on plant roots[J].Microbiological Research,2006(161):1-8.[13] 仇存璞,张海洋.芝麻枯萎病病原菌致病力室内鉴定方法[J].植物病理学报,2014,41(1):26-35.
[14] Mulder D. The pathogenicity of several Pythium species to rootlets ofapple seedlings[J]. Netherlands Journal of Medicine,1969(75):178-181.
[15] Shehata M A. Respone of susceptible and moderately resistant peagenotypes to interaction between Rhizoctonia solani and three otherstem and root rot pathgens[J]. Plant Disease,1983,67(10):1146-1148.
[16] 冯思玲.系统发育树构建方法研究[J].信息技术,2009(6):38-44.
[17] 刘琳,刘洋,刘红娟.基于16S rDNA的系统发育分析在微生物进化关系中的应用[J].生物学通报,2008,43(11):4-6.
[18] 银玲,田讯,霍万学.腐霉属菌形态学及分子生物学鉴定技术概述[J].中国蔬菜,2013,1(12):15-22.
[19] HO Hon-Hing.The genus Pythium in mainland China[J]. Mycosystema,2013,32(z1):20-44.
[20] 余永年,马忠国,王燕林.云南的腐霉[J].云南植物研究,1987,9(2):129-152.
[21] 王宽仓,查先芳.宁夏腐霉种类及其对主要蔬菜致病性的研究[J].云南农业大学报,1992,7(4):206-210.
[22] GB/T 23222—2008,中华人民共和国烟草行业标准--烟草病害分级及调查方法[S].