罗靳，薄尔琳，郭楠，郭欣硕
（辽宁省水产技术推广总站，沈阳110031）
作者简介：罗靳（1981-），女，硕士研究生，工程师，现从事水产品检测工作。E-mail：16947054@qq.com
摘要：传染性造血器官坏死病（IHNV）是一种危害极其严重的鱼类疾病。本实验用一步RT-PCR法和套式PCR法对IHNV的基因进行扩增，通过扩增片段的琼脂糖电泳分析，来判定病鱼是否携带IHNV。实验结果表明，通过一步法RT-PCR可扩增出IHNV的693bp片段；通过套式PCR法可扩增出IHNV的786bp片段和323bp片段。两种方法均能够检测待测样品中含有IHNV。比较发现一步RT-PCR法比套式PCR法更加快速、简便、敏感，减少了被污染机会。
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关键词 ：传染性造血器官坏死病（IHNV）；一步RT-PCR法；套式PCR法；方法比较
传染性造血器官坏死病（Infectioushaematopoieticnecrosis，IHN）是一种极其严重的鱼病，由传染性造血器官坏死病毒（Infectioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV）引起，一旦病毒侵入鱼体并进入血液循环后就会繁殖在鱼体的各个器官。IHNV的传播途径分为垂直传播和水平传播，一旦感染就会终生携带，条件适宜时就会成为病毒传播源。IHNV主要危害鲑鳟鱼类鱼苗及当年的幼鱼，鱼苗死亡率可达100%[1]。为了保证我国水产养殖业的健康及可持续发展，需要对IHNV进行监测，以防止疫情传播恶化。IHNV属弹状病毒科（Rhabdoviridae），诺拉弹状病毒属（Novirhabdovirus），IHNV是该属代表种[2]。IHNV病毒粒子含有一条全长约为11kb的线状、反义、单股RNA。其基因组从3′端至5′端依次编码6个蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P或者M1）、基质蛋白（M或者M2）、糖蛋白（G）、非结构蛋白（NV）和聚合酶蛋白（L）[3-5]。目前检测IHNV的方法主要包括免疫学方法如中和抗体实验[6]、间接免疫荧光[7]和ELISA[8-9]；分子生物学方法如DNA探针法[10]和PCR方法[11-15]。在这些方法中，PCR方法被证明是最便捷的方法。本实验采用的一步RT-PCR法和套式PCR法对已经被证实是已感染IHNV的病鱼检测并进行方法比较。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品试验所用的病鱼取自本溪某一养鱼场。
1.1.2试剂传染性造血器官坏死病毒IHNV一步法RT-PCR检测试剂盒，购自北京海森通生物科技有限公司。反转录试剂盒，购自唯赞生物公司。2×PowerTaqPCRMasterMix，购自北京百泰克生物技术有限公司。无水乙醇、氯仿、异丙醇，购自沈阳市试剂三厂。琼脂粉，购自Biowest。TAE，EB，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。细胞培养液M199、HEPES缓冲液，购自Corningcellgro。牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司。胰酶，购自中国医学科学院生物医学工程研究所。
1.1.3引物一步法引物：上游引物：5′-AGAGATCCCACA CAG AGA C-3′下游引物：5′-GGT GGT GTT GTT TCC GTG CAA-3′。套式法引物：上游引物F1：5′-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3′；下游引物R1：5′-CACCGTACTTTGCTGCTAC-3′；上游引物F2：5′-TTCGCAGATCCCAACAACAA-3′；下游引物R2：5′-GCGCACAGTGCCTTGGCT-3′。
1.1.4仪器设备高压蒸汽灭菌器，三洋电机株式会社MLS-3780。生物安全柜，美国NUAIRENU-437-400S。医用冷藏冷冻箱，中科美菱责任科技有限公司。低温恒温培养箱，日本三洋MIR-154。倒置生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司BDS300-PH。凝胶成像仪，美国BIO-RADXP+。基因扩增仪，北京鼎昊源科技有限公司GHS96G。低温高速离心机，德国HettichMIKR0220R。电泳仪，北京市六一仪器厂DYY-12。
1.2方法
1.2.1取样取新鲜鱼类组织脏器（肝、脑、脾、肾）2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加5mLPBS混匀，10000r/min离心10min取上清转入无菌离心管中备用。研磨后的样本在2～8℃的条件下保存不超过24h。
1.2.2细胞培养胖头鱥肌肉细胞系（Fatheadminnowcells，FHM）。刚传代的细胞在25℃细胞培养箱中生长，保存在20℃或15℃中。接种前一天进行细胞传代，细胞数量应以能让细胞在第二天内达到覆盖满90%的培养瓶为准，并且一定要在细胞传代后24h内接种病毒。第二天细胞长为单层且状态较好时，开始接种病毒。
1.2.3病毒培养及扩增取研磨后的样本一定体积接入已经生长为单层状态较好的细胞中，已接病毒的细胞在17.5℃培养。培养周期为5～7d，每天观察是否有细胞病变，如果细胞病变不明显，盲传一次，继续培养观察。
1.2.4核酸抽提一步法与套式法都采用传染性造血器官坏死病毒IHNV一步法RT-PCR检测试剂盒中的核酸抽提试剂，按照说明书操作，抽提病毒总RNA。
1.2.5逆转录聚合酶链式反应和PCR产物的检测一步法RT-PCR，完全按照传染性造血器官坏死病毒IHNV一步法试剂盒说明书操作。套式PCR法：RNA反转录，使用反转录试剂盒对待测样品RNA溶液进行反转录，①RNA模板变性。反应体系：GeneSpecificPrimersR1（1μM）1μL模板RNA7μL，共8μL。65℃加热5min，迅速置于冰水上骤冷，静置2min。②第一链cDNA的合成。第一链cDNA的合成体系：上一步的混合液8μL，2×RT-Mix10μL、HiScriptEnzymeMix2μL。第一链cDNA的合成反应程序：25℃5min、50℃45min、85℃5min，产物立即用于PCR反应。
第一步PCR反应体系：2×MasterMix12.5μL，上游引物F1（10μM）1μL，下游引物R1（10μM）1μL，模板2μL，无菌水8.5μL，共25μL。PCR循环程序：第一阶段：94℃/2min；第二阶段：94℃/45sec，62℃/45sec，72℃/60sec，30个循环；第三阶段：72℃/5min；第四阶段：4℃保存。取10μLPCR产物，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统进行拍照。
第二步PCR反应体系：第一步PCR后的产物在电泳时看到特异的DNA带，将产物按1：10至1：1000稀释后取2μL做模板，进行第二步PCR。PCR反应体系为25μL，包括2×MasterMix12.5μL，上游引物F2（10μM）1μL，下游引物R2（10μM）1μL，模板2μL，无菌水8.5μL。PCR循环程序：第一阶段：94℃/2min；第二阶段：94℃/45sec，62℃/45sec，72℃/60sec，30个循环；第三阶段：72℃/5min；第四阶段：4℃保存。取10μLPCR产物，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统进行拍照。
2结果
2.1病毒培养结果
病毒在FHM细胞中生长，并发生细胞病变。接种60小时后在4倍显微镜下观察到明显的空斑，随着培养时间增加，观察界面中许多细胞以聚小堆的形式出现，同时出现大量空斑，见图1、2、3，均为4倍显微镜下观察到的结果。
2.2一步法试剂盒RT-PCR扩增结果
从图4可以看出，阳性对照和待测样品出现一条693bp的DNA片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。证明待测样品中有IHNV，即病鱼携带传染性造血器官坏死病病毒。
1.阳性对照；2.阴性对照；3.Maker；4、5.样品；6.空白对照
从图5和图6可以看出，样品在套式PCR中经第一次PCR后待测样品在相应786bp位置上有带，并且第二次PCR扩增后能在相应323bp位置上有带，证明待测样品中有IHNV，即病鱼携带传染性造血器官坏死病病毒。
3讨论
3.1实验原理比较
两种方法调取的基因不同。一步法RT-PCR根据《ManunalofDiagnosticTestsforAquaticAnimals2012》CHAPTER2.3.4：INFECTIOUSHAEMATOPOIETICNECROSIS，通过调取G基因其中的一段特定基因，长度为693bp。套式PCR法是完全按照GB/T15805.2-2008进行，通过套式PCR检测IHNV中N基因其中的一段特定基因，长约786bp，并以此片段为模板再次PCR扩增出长约323bp的条带。
3.2特异性比较
一步法RT-PCR调取的这段基因与同属的SVCV、IPNV等同源性最差，不会引起互相干扰，从而特定判断IHNV。套式PCR中，即便第一步PCR产生了干扰条带，第二步PCR也会将干扰去除，提升其特异性。
3.3灵敏度比较
一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库，即cDNA合成与PCR反应在同一反应体系中进行，一步完成，省略了合成cDNA与PCR之间的过程，同时减少了人为的污染机会，减少了RNA二级结构，而且因聚合酶具有校正活性，从而减少了PCR反应的错配率。二步法是将RNA转录为cDNA，易于保存，并且用两对引物扩增出两条DNA片段，减少了假阳性的几率。
3.4操作时间及经济成本比较
在操作时间上，一步法用时较短，节约了时间成本和相应的实验成本。经济成本上，目前国内市场有针对IHNV检测的一步法试剂盒，可以方便快捷地进行检测，但成本较高。而市场上也有专门针对IHNV套式法的试剂盒以及适用于套式法的通用反转录试剂盒和普通PCR试剂盒种类繁多，价格差别大，如果每一步均选用进口试剂盒，总成本与一步法也会相差不多。
4结论
通过对含有IHNV病毒的鱼样进行常规的采样、提取病毒、培养病毒并对病毒进行了试剂盒一步法RT-PCR和国家标准套式PCR法两种检测方法进行检测，分别得到了相应的阳性条带并准确检测出IHNV病毒。在两种方法的比较中发现：一步法RT-PCR相对快速、简便、灵敏，减少了被污染机会。
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ComparisonoftwoDetectionmethodsforinfectious
hematopoieticnecrosisvirus（IHNV）
LUOJin，BOErlin，GUONan，GUOXinshuo
（DetectionofFisheryProductsQualitySafetyinLiaoningProvince，shenyang110031）
Abstract：Infectioushematopoieticnecrosisvirus（IHNV）isaveryseverekindoffishdiseases.Thisexperimentuseone-stepRT-PCRandnestedPCRtoamplifygeneofIHNV，
throughamplifiedgenefragments’agaroseelectrophoresisanalysis，wedeterminewhetherthediseasedfishcarryIHNV.Theexperimentalresultsshowthatbyone-stepRT-PCRwecanamplifytheIHNV693bpfragments；ThroughnestedPCRwecanamplifytheIHNVsegmentsof786bpand323bpfragment.TwotestallcantestthesampleswhichhaveIHNV.Comparedone-stepRT-PCRwithnestedPCR，itshowsthatone-stepRT-PCRmethodismorerapid，simpler，moresensitiveanditcanreducepollution.
Keywords：Infectioushematopoieticnecrosisvirus（IHNV）；one-stepRT-PCR；nestedPCR；Comparisonofplans