王 宝 赵晓会 任莹利 张文钰 郝振华
（新乡医学院三全学院，河南 新乡 453000）
【摘 要】本文研究了两种表达载体pET20b（+）和pET21a（+）对启动木聚糖酶xynⅢ表达的影响。结果表明，在原核表达系统中，xynⅢ基因在pET20b（+）载体中的表达效果好于在pET21a（+）载体中。
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关键词 外源蛋白；表达载体；原核表达
木聚糖（Xylan）是植物半维素的主要成份，它是复杂的低分子质量的多糖，由β-D-木糖残基通过β-1，4键连接成的主链和携带的各种取代基组成[1]。木聚糖是自然界中主要的可再生有机资源[2]，但长期以来得不到充分的重视和利用，造成极大的浪费。现在，借助微生物代谢已成为降解利用木聚糖的重要工具，木聚糖酶已被应用到造纸工业、食品加工、饲料、生物转化等行业领域。实现木聚糖酶商业化的必要条件是获得大量表达木聚糖酶的微生物菌株。重组DNA技术为蛋白质产量的提高提供了技术手段，现已有上百种来自细菌和真菌等微生物的木聚糖酶基因被克隆出来并成功地在多种原核和真核表达系统中表达。
已将β-1，4-内切木聚糖酶xynⅢ基因成功地连接到原核表达载体pET20b（+）（分子量为3716bp）和pET21a（+）（分子量为5443bp）上，并转化入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）。为了确定xynⅢ基因在哪个载体中更能高效表达，本实验对其作了研究比较。
1 材料与方法
1.1 材料
（1）菌株与载体 大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）为实验室保藏菌种。pET20b（+）和pET21a（+）为Novagen公司产品。
（2）主要试剂 胰蛋白胨（Tryptone），酵母抽提物（Yeast Extract），琼脂糖（Agarose）,牛血清蛋白，桦木木聚糖等生化试剂均为TaKaRa产品；氨苄青霉素Amp购自创生公司，DNA分子量Marker（DL2000、 λHindⅢ）购自TaKaRa公司，蛋白质分子量Marker购自宝赛公司，氢氧化钠、氯化钠等普通试剂为分析纯。
（3）主要仪器 SK18型高速冷冻离心机，Sectrophotometer ND-1000，JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，DYY-5型稳压稳流电泳仪，衡温振荡培养箱，紫外透射仪紫外分光光度计。
1.2 方法
1.2.1 质粒的提取
（1）挑取含有重组质粒pET21a（+）-xynⅢ和pET20b（+）-xynⅢ的单克隆，分别接种于10 ml含有100mg /mL Amp的LB液体培养基中，37 ℃，220 rpm，摇床过夜培养。
（2）用紫外分光光度仪检测菌体浓度显示均为2.2，剩余菌液用碱裂解法提取质粒DNA，并用Sectrophotometer ND-1000测其浓度。
1.2.2 PCR扩增xynⅢ，并通过电泳检测扩增产物的亮度
分别以重组质粒pET21a（+）-xynⅢ和pET20b（+）-xynⅢ为模板对xynⅢ进行PCR扩增，PCR体系如下：
PCR程序：94℃ 3min；94℃ 30s，52.8℃ 30s，72℃ 40s，15个循环；72℃ 7min。
1.2.3 SDS-PAGE电泳检测外源蛋白表达
（1）挑取含有重组质粒和含有空质粒pET21a（+）/pET20b（+）的单克隆，分别接种于3 ml含有50mg /mLAmp的LB液体培养基中，37 ℃，220 rpm，摇床过夜培养。
（2）取上述过夜培养物以1/100的比例转接入含50 mg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm，培养2-3h（OD值达到0.6-0.8），加入IPTG于30 ℃条件下诱导培养 6 h。
（3）分别取IPGT诱导前和诱导后的菌液样品l ml，收集菌体，用30 uL的PBS缓冲液（pH7.2） 重悬细胞沉淀，再加入6× SDS-PAGE buffer，混匀后100 ℃煮沸10 min，离心取上清，即可用于SDS-PAGE检测。
1.2.4 蛋白含量测定
采用Bradford法测定蛋白浓度[3]，以牛血清蛋白作为标准蛋白。
蛋白浓度C=（91.69Y+2.743）/V
其中:C——蛋白浓度，单位μg/μl；
Y——A595值；
V——加样体积，单位μl。
2 结果
2.1 质粒浓度的测定结果
用Sectrophotometer ND-1000对提取的质粒测浓度。结果如表2。
由此可以看出：在菌体浓度相同的情况下，分子量小的质粒对菌体细胞造成的负荷较小，从而在细胞中的扩增倍数较多。
2.2 PCR扩增xynⅢ的电泳检测结果
分别以质粒pET21a（+）-xynⅢ和pET20b（+）-xynⅢ为模板对xynⅢ进行PCR，通过电泳检测（如图1）可以明显看出以pET20b（+）-xynⅢ为模板扩增的基因产量高。足以说明在相同体积下pET20b（+）-xynⅢ质粒浓度大。
2.3 pET21a（+）-xynⅢ 和pET20b（+）-xynⅢ表达产物检测结果
以大肠杆菌的超声波破碎酶液为对照：将全细胞蛋白和超声波破碎细胞离心后得到的上清酶液进行SDS-PAGE检测，如图2所示，有明显的外源蛋白产物条带出现；pET20b（+）-xynⅢ表达产物的条带明显比pET21a（+）-xynⅢ表达产物的条带亮。
2.4 蛋白含量的测定
在595nm下，用紫外分光光度仪测两种重组菌的酶液上清的吸光值，得到表3的数据，进而带入公式计算出各蛋白的浓度。明显看出pET20b（+）-xynⅢ表达产物的量多于pET21a（+）-xynⅢ表达产物的量。
3 讨论
外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：外源基因的拷贝数。本实验所选用的pET20b（+）载体因为其分子量小于pET21a（+）载体的分子量，在细胞内进行扩增时对细胞造成的负荷会小一点，所以pET20b（+）载体的拷贝数多于pET21a（+）载体的，进而载体上所连接的外源基因的拷贝数也多，因此外源基因的表达产量会相对的增多。
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参考文献
［1］张世敏，刘寅，刘新育，等.木聚糖酶基因研究进展[J].微生物学杂志，2006，7，26（4）:61-67
［2］何成新，张厚瑞.木聚糖水解酶的研究进展[J].广西轻工业，1998，4:12-15.
［3］Bradford M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Proein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding[J].Anal Biochem，1976，72：248-254.
［责任编辑：许丽］