doi：10.13360/j.issn.1000-8101.2015.04.007中图分类号：S718.43
刘春风1，谢寅峰2*，张往祥2
（1.江苏农林职业技术学院风景园林系，江苏 句容 212400；2.南京林业大学）
摘要：为了解观赏海棠对高温的适应性，以欧美观赏海棠8个品种为材料，研究其在田间自然高温条件下的生理适应机理。结果表明：高温胁迫下，随着温度的升高，8个海棠品种的膜透性增大，丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢（H2O2）含量、脯氨酸（Pro）含量升高；可溶性蛋白含量先升高后下降。相对电导率、MDA含量、SOD活性、Pro含量、可溶性蛋白含量可以作为鉴定海棠品种的耐热性生理指标。8个海棠品种均能在试验地安全越夏，耐热性由强到弱排列顺序为‘Strawberry’>‘Abundance’>‘Robinson’>‘Radiant’>‘Adams’>‘Sentinel’>‘Pink Spire’>‘Royalty’。耐热性较强的品种为‘Strawberry’、‘Abundance’和‘Robinson’；耐热性中等的品种为‘Radiant’、‘Sentinel’和‘Adams’；耐热性较弱的品种为‘Pink Spire’和‘Royalty’。
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关键词 ：海棠；嫁接苗；高温胁迫；生理生化指标
收稿日期：2014-07-22
修回日期：2015-05-09
基金项目：江苏省农业自主创新项目（CX［12］2043）；江苏省科技厅农业科技支撑项目（BE2012351）；江苏省科技支撑计划（BE2014407）。
作者简介：刘春风（1970-），女，讲师，主要从事园林植物栽培研究工作。通信作者：谢寅峰，男，副教授。E?mail：xxyyff@njfu.com.cn
Physiological response of different crabapple varieties to high temperature stress
∥
LIU Chunfeng， XIE Yinfeng， ZHANG Wangxiang
Abstract：In order to learn the adaptability of various crabapple varieties to high temperature stress，we researched the phy?siological response of grafting seedlings of eight crabapple varieties to high temperature stress under the hot field conditions. Results showed that high temperature stress increased the membrane permeability， the content of MDA， H2O2，Pro and the activity of SOD，the content of soluble protein increased initially and then declined with the increasing of temperature under high temperature stress.Therefore， we argued that the relative conductivity， the content of MDA， soluble protein， Pro and the activity of SOD could be used as indices to detect the heat resistance of crabapple. Eight crabapple varieties， which were safe in the summer experimental field， were ranked as follows：‘Strawberry’>‘Abundance’>‘Robinson’>‘Radiant’>‘Adams’>‘Sentinel’>‘Pink Spire’>‘Royalty’. The most heat?tolerant crabapple varieties were ‘Strawberry’，‘Abundance’ and ‘Robinson’，the medium heat?tolerant varieties were ‘Radiant’，‘Sentinel’ and ‘Adams’，the weak heat?tolerant varieties were ‘Pink Spire’ and ‘Royalty’.
Key words：crabapple； grafting seedling； high temperature stress； physical and biochemical index
First author’s address： Department of Landscape Architecture， Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry， Jurong， 212400， Jiangsu， China
海棠（Malus spp.）具有观花、观果、观叶等观赏价值和较强的环境适应能力，主要分布在北温带、横跨欧亚大陆和北美洲，广泛应用于各种园林景观中［1］。海棠喜光、耐寒，一般在年平均气温7～14 ℃地区分布［2］。近年来，随着我国城市化建设步伐的加快，各地相继从国外引进优良的观赏海棠品种，并试图将观赏海棠向南推广，这些引进资源的抗逆性和适应性是栽培者普遍关注的问题，尤其对高温的适应性问题将影响其引种驯化、推广栽培区的范围。目前国内外的主要研究集中在观赏海棠品种调查和分类、引种筛选和栽培育种、形态、生理生化变化、干旱胁迫等方面［3-6］，关于观赏海棠对高温适应性的研究较少。因此，本试验对高温胁迫下8个品种观赏海棠生理生化变化进行研究，旨在为观赏海棠的南移推广栽培奠定理论基础。
1材料与方法
1.1试验地概况
试验地位于南京市溧水区傅家边农业开发区（118°22′～119°14′E，31°14′～32°37′N），属亚热带季风气候，年均气温15.5 ℃，年极端气温最低－13.1 ℃，最高39.7 ℃，年均降水1 037 mm，年均日照2 146 h。土壤为黄棕壤酸性黏土。
1.2试验材料
供试材料来源于南京林业大学引进的观赏海棠品种2年生嫁接苗。首先对观赏海棠27个品种进行1 a的形态和生长观察，在以形态表现（热害指数）和苗高生长速率为评价依据进行耐热性评价的基础上，将其分为耐热性强、中等、弱3个等级，从3个等级中选取8个品种进行耐热性比较试验，耐热性较强的品种为B10（M.‘Strawberry’）、B4（M.‘Abundance’）、B5（M.‘Radiant’），耐热性中等的品种为A2（M.‘Sentinel’）、B7（M.‘Robinson’）、B19（M.‘A?dams’），耐热性弱的品种为B9（M.‘Pink Spire’）、A4（M.‘Royalty’）。试验地地势平坦，土壤深翻50 cm。每个品种种植150株，采用完全随机试验设计， 2012年3月定植，株行距为1 m×2 m。每个品种选20株标准木进行测定。
1.3试验方法
采用田间自然高温条件法，2012年5—9月每天记录试验地当天的天气情况。温度梯度设置：连续5～7 d日平均最高气温/月极端最高温度为28 ℃/33 ℃（5月）、33 ℃/35 ℃（6月）、36 ℃/39 ℃（7月）、32 ℃/35 ℃（8月）、27 ℃/32 ℃（9月）。以日平均最高气温28 ℃（适宜海棠生长）为对照，日最高气温32～36 ℃为高温胁迫（在1 a的形态观察中发现，当日最高气温高于32 ℃时，部分品种出现新叶枯焦的日灼现象，因此将日最高气温高于32 ℃确定为高温胁迫）。随机采集标准木上部第5～8节位完全功能叶片，采样后放入-70 ℃的超低温冰箱冷冻。
相对电导率用电导仪测定法测定；丙二醛含量（MDA）测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染色法；脯氨酸（Pro）含量测定采用磺基水杨酸提取-酸性茚三酮显色法；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法；过氧化氢（H2O2）含量测定采用硫酸钛显色法［7］。
1.4数据处理
试验数据采用Excel 2010和spss 18.0程序分析。
2结果与分析
2.1试验地气温统计
2012年5—9月试验地的平均气温、极端气温及高温天数统计可知，5个月日平均最高温度分别为28，33，36，32和27 ℃，极端最高温度分别为33，35，39，35和32 ℃，30 ℃以上天数分别为9，15，29，24和8，其中35 ℃以上高温天数分别为0，3，14，5和0，日最高温度持续30 ℃以上的天气集中在6月8—16日、6月29日—7月12日、7月15日—8月7日、8月10—21日。7月21—31日出现持续11 d的36～39 ℃高温天气。
2.2高温胁迫对相对电导率和丙二醛含量的影响
随着温度的升高，不同品种海棠细胞膜透性增大，细胞内原生质外渗，叶片的相对电导率均不同程度地增加，品种间差异显著（P<0.05）（图1a）。在36 ℃高温胁迫下，与耐热性强的品种比较，耐热性弱的品种其相对电导率增幅较显著。耐热性弱的品种A4、B9和B19的相对电导率均超过50%，而耐热性强的品种B4、B10和B5的相对电导率均低于35%，表明高温胁迫较大程度地破坏了耐热性较弱的品种A4、B9和B19叶片细胞膜的透性，对耐热性较强的品种B4、B10和B5的叶片细胞膜造成伤害程度较小。其中，品种A4叶片的相对电导率达到68.6%，较对照增加了5.2倍，增加幅度最显著；其次是品种B9（56.9%）和B19（50.5%），分别较对照增加了3.0和2.9倍；而品种B4、B10和B5的叶片相对电导率较对照增加幅度较小，分别增加了1.18，1.55和1.87倍。相对电导率增幅由大到小排序为A4>B9>B19>A2>B7>B5>B10>B4。
高温胁迫下，不同海棠品种的MDA含量均高于对照，且随着温度的升高而升高，品种间差异极显著（P<0.01）（图1b）。在36 ℃高温胁迫下，与耐热性弱的品种比较，耐热性强的品种其MDA含量增幅较低。耐热性弱的品种A4和B9的MDA含量较对照分别增加了92%和91%，极显著高于其他品种。品种B19、B5和A2的MDA含量增幅在16%～35%，居中等。而耐热性强的品种B10、B7和B4的MDA含量增幅不明显，远低于其他品种的MDA含量。MDA含量较高的品种A4和B9是含量较低品种B10、B7和B4的4～10倍。MDA含量由大到小排序为A4>B9>B19>A2>B5>B10>B4>B7。
2.3高温胁迫对超氧化物歧化酶活性和可溶性糖含量的影响
高温胁迫下，海棠8个品种的SOD活性均高于对照，且随着温度的升高而增强，品种间差异极显著（P<0.01）（图2a）。SOD活性上升表明SOD对高温后产生氧自由基胁迫出现积极的响应，通过增加其活性来降低高温胁迫引起的膜脂过氧化程度。在36 ℃高温胁迫下，耐热性强的品种B10的SOD活性上升幅度极显著高于其他品种，较对照增加了138.76%，其次是品种B7，较对照增加了84.94%；而耐热性弱的品种A4的SOD活性上升幅度最小，仅比对照增加了9.94%，其次是品种B9，较对照增加了15.65%。品种A2、B5、B4和B19的SOD活性分别较对照增加了41.6%，33.89%，33.44%和26.44%。SOD活性增幅由大到小排序为B10>B7>A2>B5>B4>B19>B9>A4。
在高温胁迫下，海棠8个品种的可溶性糖含量均高于对照，且随着温度的升高而升高，品种间差异极显著（P<0.01）（图2b）。与对照相比，在36 ℃高温胁迫下，品种B19的可溶性糖含量增加幅度最大，大于50%，其次是A4和B9的可溶性糖含量上升幅度在40%左右；品种B10和A2的可溶性糖含量上升幅度很小，仅4%左右。可溶性糖含量增幅度由大到小排序为B19>A4>B9>B4>B7>B5>A2>B10。
2.4高温胁迫对脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响
高温胁迫下，海棠8个品种的Pro含量均高于对照，且随着温度的升高而升高，品种间差异显著（P<0.05）（图3a）。与对照相比，在36 ℃高温胁迫下，品种B7的Pro含量增加幅度显著大于其他品种，近54%；品种B10和B5的Pro含量增加幅度在42%～45%之间；而品种A4的Pro含量增加幅度不足25%。脯氨酸含量增幅度由大到小排序为B7>B10>B5>B4>A2>B19>B9>A4。
高温胁迫下，8个品种海棠的可溶性蛋白含量表现不一致，品种间差异较大（图3b）。与对照相比，品种A4、B9、A2在33 ℃时的可溶性蛋白含量开始上升，在36 ℃时的可溶性蛋白含量下降；其他品种在36 ℃时的可溶性蛋白含量开始上升。原因可能是A4、B9和A2在33℃时已经受到高温胁迫，引起热激蛋白的表达，可溶性蛋白含量较其他品种高，在36℃时热激蛋白含量减少，可溶性蛋白含量下降；其他品种则在36 ℃时受到高温胁迫，引起热激蛋白的表达，可溶性蛋白含量开始升高。36 ℃高温胁迫下，品种B10和B4的可溶性蛋白含量上升幅度显著，表明高温促进了品种B10和B4的蛋白合成，使它们的蛋白质含量剧增；B5、B7和B19的可溶性蛋白含量上升幅度较小；品种A4、B9和A2的可溶性蛋白含量下降。表明高温胁迫导致它们的蛋白质水解，使蛋白质含量降低。其中，品种A4蛋白质含量降幅最大，其次是B9。蛋白质含量增幅由大到小排序为B10>B4>B7>B5>B19>A2>B9>A4。
2.5高温胁迫对过氧化氢含量的影响
在高温胁迫下，8个品种海棠的H2O2含量均高于对照，且随着温度的升高而升高，品种间差异极显著（P<0.01）（图4）。与对照相比，在36 ℃高温胁迫下，品种B9、A4、B5、B19、B4、B7、B10和A2的H2O2含量增幅分别为176.80%，132.10%，110.60%，81.40%，67.00%，63.76%，53.68%和32.55%。可以看出，品种B9、A4和B5的H2O2含量增幅都超过1倍以上。其中，品种B9的H2O2含量增幅极显著高于其他品种，增幅近2倍，其次是品种A4，再次是B5。而品种A2的H2O2含量增加幅度最小，其次是B10。H2O2含量增幅由大到小排序为B9>A4>B5>B19>B4>B7>B10>A2。
2.6不同海棠品种耐热性综合分析
在植物耐热性鉴定方法中，外部形态指标是反映植物耐热性的重要指标之一。热害指数能反映植物在高温胁迫下的外观形态表现，鉴定植物的抗热性。苗木生长指标是判断苗木抗逆能力最直接的鉴定指标。苗高生长速率的大小可作为评价耐热性的一个指标。本试验用苗高指标增长速率比较各品种海棠的耐热性结果与田间形态观察结果一致，耐热性由强到弱排列顺序为：B10>B4>B5>B7>B19>A2>B9>A4［8］。
植物受高温伤害的主要部位是细胞膜系统。表1中各生理指标均与细胞膜的稳定性具有密切联系，其中Pro含量、SOD活性、蛋白质含量均是维持细胞膜的热稳定性。而丙二醛表示膜脂过氧化的程度，是细胞膜被破坏的标志物质。叶片相对电导率大小可以反映细胞膜渗透性和电解质的泄漏。因此，丙二醛、叶片相对电导率可以作为衡量细胞膜热稳定性的关键指标。在判断植物的耐热性上，本试验以丙二醛、叶片相对电导率为准，其他生理指标作为辅助指标，综合判断各品种的耐热性。这两个生理指标的排序结果基本一致（除品种B7外）：相对电导率增幅由小到大排序为B4<B10<B5<B7<A2<B19<B9<A4；MDA含量由小到大排序为B7<B4<B10<B5<A2<B19<B9<A4。从Pro含量、SOD活性和蛋白质含量3个指标中含量（或活性）的等级（表1）可以看出，品种B10排序较前，其次为B7，再次为B4。从各个生理指标看，品种B10排序均在耐热性较强的等级中，B7和B4排序较不稳定，比较二者，B7比B4排序较前，B7>B4；其他品种为B5>A2>B19>B9>A4。因此，综合生理指标耐热性由强到弱排序为：B10>B7>B4>B5>A2>B19>B9>A4。生理指标结合形态和生长指标看，B4在耐热性较强的等级中比B7多，B4的耐热性较B7强，即B4>B7。
在高温胁迫下，细胞膜系统仅次于细胞壁感受到胁迫信号，经信号传导途径将胁迫信号传递至细胞内，引起植物体内酶活性的变化，造成植物的细胞结构和重要生理反应的改变。当高温胁迫所造成的伤害超过植物自身的调控能力时，植物就开始表现出外观形态的热害症状［9］。由各单项指标的相关系数（表2）可知，田间热害指数与苗高增长速率、相对电导率呈极显著相关水平，与MDA呈极显著相关水平，说明热害指数能够基本代替苗高增长速率、相对电导率、MDA，最终在形态上反映植物的耐热性，因此，鉴定植物耐热性可以外观形态上显著的热害症状为主要指标，结合苗高增长速率、相对电导率、MDA指标综合判断。根据田间热害指数观察，气温超过32 ℃后，A2、A4和B9海棠品种即表现出新梢枯焦变黑的热害症状，其他品种则长势良好。因此，认为A2、A4和B9海棠品种为耐热性较弱的品种。综合分析认为8个品种海棠均能在试验地安全越夏，耐热性由强到弱排列顺序为：B10>B4>B7>B5>B19>A2>B9>A4。耐热性较强的品种为B10、B4和B7；耐热性中等的品种为B5、A2和B19；耐热性较弱的品种为A4和B9。
本试验所选生理生化指标经方差分析具显著性差异，能有效区分海棠不同品种的耐热性，但不同生理生化指标所测得的结果不尽一致。相对电导率、MDA含量、SOD活性、Pro含量、可溶性蛋白含量与海棠耐热性密切相关，可以作为海棠品种的耐热性鉴定生理指标。其中，相对电导率、MDA含量、SOD活性和Pro含量为耐热性鉴定中得到普遍认可的生理指标［10-11］。
3结论与讨论
1）高温胁迫后，8个品种海棠的相对电导率、过氧化氢（H2O2）含量、MDA含量均显著提高，并且与品种的耐热性呈负相关。与耐热性强的品种比较，耐热性弱的品种相对电导率、过氧化氢（H2O2）含量、MDA含量增幅均较大，说明耐热性强的海棠品种对高温逆境适应性较强，这与许多研究者对其他植物的研究结果一致［12-16］。品种A4、B9、A2的MDA含量极显著高于其他品种的，与其田间的形态表现一致，3个品种在33 ℃即出现了新叶叶尖枯焦的现象［8］，此现象也证实了它们对高温较敏感，较不耐热性。
2）在对照条件下，品种间超氧化物歧化酶活性差异显著，品种A2、A4、B9的SOD含量显著高于其他品种。极有可能是3个品种由于对高温的较不耐热性导致它们在对照温度条件下就诱导了SOD活性上升，使它们的SOD含量显著高于其他品种。而耐热性较强的品种B10的SOD活性，在对照温度条件下显著低于其他品种，在高温下增幅极显著高于其他品种，其苗高地径也始终保持比其他品种较快的生长速率［8］。
3）高温胁迫下，海棠各品种的脯氨酸含量明显增加，且增幅与品种耐热性呈正相关，耐热性强的品种其脯氨酸含量增幅高于耐热性弱品种，这一结论与前人的研究结果一致［3，17］。高温胁迫下，耐热性强的品种B10、A2其可溶性糖含量增幅很小，仅4%左右；耐热性弱的品种A4、B9、B19的可溶性糖含量增幅很大，在40%～50%。可见，在高温胁迫下海棠品种叶片可溶性糖含量增幅与品种的耐热性具有负相关性。此结论与欧祖兰等［17］和郑军［18］的研究结果不一致。贾开志等［19］对不同茄子耐热性进行研究时并没有发现在热胁迫下不同品种茄子的可溶性糖含量的变化与茄子耐热性有显著相关性。虽然许多研究表明在热胁迫下植物体内的可溶性糖在细胞质中大量积累，但有关可溶性糖积累量与植物耐热性的相关性研究较少。
4）当植物体受到热激时（高于植物正常生长温度8～12 ℃），植物体内正常蛋白的合成受到抑制，可以很快诱导合成热激蛋白。在植物热激处理后3～5 min内，热激蛋白短时间迅速大量表达。热激蛋白可以与变性蛋白结合，维持它们的自然状态，以减少植物细胞受到的伤害。但是，热激蛋白只是热胁迫下植物体内出现的应激蛋白质，在持续高温作用下胁迫超过一定程度时，蛋白质的变性很快转变为不可逆的凝聚状态和降解，从而使植物体遭受损害［20］。耐热品种对高温反应迟钝，热激蛋白诱导温度高，蛋白质降解速率慢；不耐热品种对高温反应较敏感，热激蛋白诱导温度较低（38 ℃，36 h），在较高温度（42 ℃，36 h）刺激后热激蛋白合成受抑制，可溶性蛋白质含量下降。本试验研究结果与孟焕文等［21］的研究结果一致。耐热性较弱的品种A4、B9、A2热激蛋白启动较早，气温33 ℃时即诱导了它们的热激蛋白的合成，可溶性蛋白含量增加， 36 ℃时可溶性蛋白含量下降；而耐热性较强的品种B10、B4热激蛋白启动较晚，在较高温度36 ℃时才出现可溶性蛋白含量的剧增。在外部形态上进一步得到了印证：气温33 ℃持续2～3 d后，品种A2、A4、B9即表现出新梢枯焦变黑的热害症状，其他品种则长势良好。在36 ℃持续高温11 d后，耐热性较强的品种B10只是叶片稍微上卷，受高温影响最轻；品种B4、B7、B19、B5叶片40%～60%卷缩［8］。说明耐热性弱的品种A2、A4、B9热激蛋白启动早，诱导温度低，耐持续高温的能力弱，短时间的持续高温（33 ℃2～3 d）则使其蛋白质合成受阻、蛋白质的变性很快转变为不可逆的凝聚状态和降解而相继出现热害。
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（责任编辑 田亚玲）