摘要： 本文以红颜草莓叶片和匍匐茎为外植体，进行无毒苗离体培养，通过不同灭菌和诱导处理，得出组织培养方法诱导草莓植株再生的适宜方案。结果表明，幼嫩叶片和匍匐茎分别采用75%酒精浸泡20 s和 30 s后用无菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用无菌水漂洗5遍后再用滤纸迅速吸干接种，获得无菌株成功率达90%以上；叶片诱导分化适宜培养基为6 - BA 0.2 mg/L + IBA 0.1 mg/L + GA3 0.1 mg/L；匍匐茎尖诱导分化适宜培养基为6 - BA 0.1mg/L + IBA1 mg/L。
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关键词 ： 草莓；幼嫩叶片；茎尖；离体培养
草莓是蔷薇科宿根多年生常绿草本植物，具有适应性广，生长周期长，结果多，果实颜色鲜艳，肉质细嫩柔软多汁，甜酸适口，风味独特，果实营养丰富以及经济价值高的特点，是人们喜爱的果品之一。在世界浆果类水果生产中，草莓的栽培面积和产量仅次于葡萄，为世界性第二大浆果水果[1]，近年来，研究进一步发现草莓含有鞣花单宁、花青素苷、天竺葵素、矢车菊素等类黄酮生物活性物质，能在很大程度上防止心脑血管、癌症和老年神经变性等疾病的发生，草莓也因这些抗氧化活性物质所具有的独特医疗保健功能愈加受到消费者青睐[2-4]。草莓生产中主要靠匍匐茎压枝和分枝繁殖，在长期的生产和繁殖过程中，草莓极易感染和传染病毒，造成多种病毒病的侵染率不断提高[5]，病毒对草莓的危害十分严重，病毒导致减产可达30% ~ 80%[6]，目前，草莓植株体内已经发现62种病毒，其中，在我国危害大，分布广，造成损失严重的主要有草莓皱缩病毒、斑驳病毒、轻型黄边病毒和镶脉病毒[7]。这些病毒多是蚜虫传播，而草莓自身对病毒没有免疫能力。病毒容易引起叶片黄化或叶缘失绿，幼叶反卷，成熟叶片产生坏死条斑或叶脉坏死、扭曲，甚至出现叶片枯死、植株矮化、老叶变红，造成草莓长势极弱，产量和品质严重下降，且草莓病毒病会随着草莓营养繁殖而代代相传。到目前为止，尚没有特效药或特效方法治愈草莓病毒病。
采用茎尖培养法进行无毒苗的培育，是目前世界上获得草莓无毒苗最普遍且最有效的方法，采用无毒材料培养的秧苗无病毒，生长健壮，叶片浓绿，繁殖快，果实品质较好，产量较高。本试验以“红颜”品种为试材，探讨以叶片、茎尖离体培养再生植株获得草莓无毒苗的技术方法，不仅为建立草莓脱毒苗离体培养体系奠定基础，而且也为草莓种苗脱毒和大规模生产提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料为第六师国家科技园区温室大棚栽培的“红颜”草莓品种。
1.2 不同外置体处理
草莓植株毛面遍布绒毛，从田间选取生长健壮、无病虫害、典型性状优良的植株为母株，剪取刚抽出的匍匐茎茎尖约3 cm和幼嫩的叶片，分别用1%洗洁精水溶液浸泡5 min，并用玻璃棒轻微搅动后，再用自来水冲洗30 min，无菌水冲洗1遍后移入超净工作台。根据表1对不同外植体进行灭菌处理，将匍匐茎尖和叶片分别放入灭菌烧杯中。倒入75%酒精分别浸泡20 s、30 s，无菌水冲洗3次，转入0.1%升汞溶液轻微搅动4 min、5 min、8 min，用无菌水冲洗5次，用滤纸迅速吸干水分。各处理分别接种50个外植体，10 d后统计外植体数量，并对外植体损伤情况进行统计。
1.3 诱导分化培养
1.3.1 叶片离体再生
将消毒后的叶片切成5 mm左右小块作为外植体，诱导培养基MS为基础培养基，附加不同植物生长调节剂浓度配比（见表2）。
每瓶放置1片外植体，放置于恒温培养室，在22 ~ 25°C，光照2 000 - 3 000 Lx，光照时间16 h条件下进行培养，2周后叶片周围出现愈伤组织，30 d后有绿色芽点。
1.3.2 匍匐茎尖诱导分化
在超净工作台上，40倍显微镜下，剥取匍匐茎尖（带1 ~ 2个叶原基）。按照表3对匍匐茎尖诱导分化处理，每瓶接种1个茎尖外植体，接种好后放置于恒温培养室，在温度22 ~ 25 °C，光照2 000 ~ 3 000 Lx，光照时间16 h条件下进行培养，仔细观察生长情况发现，在1周后绿点慢慢长大，4周后出现丛生芽点。
2 结果与分析
2.1 不同外植体灭菌结果
草莓的幼嫩叶片和匍匐茎都能诱导分化，从表4可以看出，叶片采用A2处理时外植体灭菌效果好，损伤程度低。匍匐茎采用A5外植体灭菌效果好，损伤程度低。即：叶片采用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5 min后用无菌水漂洗5遍处理效果较好； 匍匐茎采用75%酒精浸泡30 s，用无菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5 min后用无菌水漂洗5遍的处理效果较好。
2.2 不同外植体诱导分化结果
从表5可以看出，B1 、B2、 B3丛生的芽点少，诱导率低于50%，而叶片诱导分化B4芽点多，长势良好， B6芽点也多，但B6出现幼苗有轻度的玻璃化，因此，以B4最好。
从表6可以看出，C1、C2的诱导率偏低，C4、C5、C6的诱导率低于90%，C3匍匐茎诱导分化大于90%，芽点状态较好，因此，以C3处理诱导分化效果较好。
3 小结
（1）本文研究表明，叶片采用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5 min后用无菌水漂洗5遍后用滤纸迅速吸干接种，成功率达到90%以上，匍匐茎采用75%酒精浸泡30 s，用无菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5 min后用无菌水漂洗5遍后用滤纸迅速吸干接种，成功率达到93%以上。（2）细胞分裂素能促进植物体细胞的分裂以及器官诱导生长，从而对不定芽的产生获得积极的影响，叶片诱导分化以B4最好，即叶片诱导培养基6 - BA 0.2 mg/L + IBA 0.1 mg/L + GA3 0.1 mg/L。匍匐茎诱导分化C3最好，即6 - BA 0.1mg/L + IBA1 mg/L。
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参考文献
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[2]杨秀娟，赵晓燕，马越，等.花青素研究进展[J].中国食品添加剂.2005，4：40-42.
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[4]张宁，胡宗利，陈绪清，等.植物花青素代谢途径分析及调控模型建立[J].中国生物工程杂志.2008，28（1）：41-44.
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