殷 杰，王 蒙，曾小波，马志勇，程国军
（中南民族大学生命科学学院，武汉 ４３００７４）
摘要：从根际土壤分离到一株细菌ＣＹ０４，通过电镜观察和１６Ｓ ｒＤＮＡ 序列分析，发现该菌株同已知菌枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）的相似度最高，为９９％， 初步认定为枯草芽孢杆菌。抑菌试验结果表明，该菌株对金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）有一定的抑菌活性，对大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和枯草芽孢杆菌没有抑菌活性。培养４８ ｈ左右是其产生抗菌活性物质的最佳时期。
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关键词 ：根际土壤；枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；鉴定；抑菌活性
中图分类号：Ｑ９３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０３４６－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０２２
随着有害生物耐药性问题的加剧，微生物产生的活性成分物质在人类疾病防治、动物医药保健、植物抗病害及食品防腐等方面表现出巨大的应用潜力。枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）通过产生多种抗菌代谢产物，能有效抑制病原菌并促进动植物生长，具有较高的工业、农业以及医药应用价值［１］，同时，枯草芽孢杆菌也被认为是潜在的益生菌［２］。
目前已知枯草芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，包括细菌素、脂肽类抗生素以及酶类、蛋白类抑菌物质等［３］。从枯草芽孢杆菌中分离的Ｆｅｎｇｙｃｉｎ能够抑制多种重要植物病原真菌的生长［４］。本研究从根际土壤样品中分离到一株能产生抗菌物质的细菌ＣＹ０４，并根据形态学特征和１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列对其进行了鉴定，初步认定其为枯草芽孢杆菌，同时对它的拮抗情况及产生原因进行了探讨。
１ 材料与方法
１．１ 抗菌活性物质产生菌种的筛选
在带有玻璃珠的三角瓶中加入根际土样１ ｇ和９９ ｍＬ蒸馏水，放置于２８ ℃摇床内振荡３０ ｍｉｎ，取样做梯度稀释后，用其涂布牛肉膏蛋白胨平板，置于３７ ℃生化培养箱中培养４８ ｈ，从中分离出细菌单株；以金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）为检测菌，采用纸片法进行菌株筛选，并对产生活性物质进行验证试验。
１．２ ＣＹ０４细菌的个体形态和电镜观察
在ＬＢ平板上观察菌落形态，利用革兰氏染色法在油镜下观察菌体形态。将菌株用戊二醛固定，ＰＢＳ洗涤和梯度乙醇脱水，真空冷冻干燥机干燥，扫描电镜观察、拍照。电镜放大倍数１５ ０００。
１．３ ＣＹ０４细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列测定和系统进化分析
用ＬＢ培养基摇床培养菌体至对数期，离心后收集菌体，抽提细菌基因组的总ＤＮＡ。以ＣＹ０４菌株基因组ＤＮＡ为模板扩增１６Ｓ ｒＤＮＡ基因片段［５］。扩增引物选用细菌通用ＰＣＲ引物１６Ｓ－Ｆ（５′ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ３′）、１６Ｓ－Ｒ（５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３′）。扩增程序为，９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５６ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，３０次循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶回收，克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体［宝生物工程 （大连）有限公司］，经酶切和ＰＣＲ验证后，送北京擎科新业生物技术有限公司测序。序列提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行同源性比较分析。采用Ｂｉｏｅｄｉｔ和ＭＡＧＥ ４．０软件以邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）构建系统进化树［６］。
１．４ 菌株ＣＹ０４对不同指示菌拮抗能力的测定
以大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌为指示菌，采用牛津杯（内径６ ｍｍ，外径８ ｍｍ）法测定菌株ＣＹ０４对不同指示菌拮抗能力［７］。取已活化的指示菌菌液接入牛肉膏蛋白胨液体培养基，３７ ℃、２０ ｒ／ｍｉｎ培养２４ ｈ。倒牛肉膏蛋白胨平板，在每个平板的中央置一个已灭菌的牛津杯，吸取指示菌菌悬液在平板上均匀涂布，待平板晾干后进行抑菌试验。将ＣＹ０４菌株培养液离心，取上清液加入到牛津杯中，３７ ℃恒温培养箱中培养４８ ｈ，观察生长情况并测量抑菌圈直径。
将活化后的菌株ＣＹ０４按２％的接种量接入牛肉膏蛋白胨培养液中，每隔６ ｈ取菌液离心，将上清液加入到牛津杯中，测定其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，确定产生活性物质的最佳时期。
１．５ 菌株ＣＹ０４的抗性测定
以抗生素卡那霉素（Ｋｍ）、氨苄青霉素（Ａｐ）、链霉素（Ｓｔｒ）、四环素（Ｔｃ）、庆大霉素（Ｇｍ）、氯霉素（Ｃｍ）、壮观霉素（Ｓｐｅ）为抗生活性物质，测定菌株ＣＹ０４对抗生活性物质的抗性。将菌株ＣＹ０４接种到ＬＢ培养液中，３７ ℃摇床培养过夜。按２％的接种量将菌株接种于含不同浓度抗生素的ＬＢ液体培养基中，３７ ℃摇床（２００ ｒ／ｍｉｎ）振荡培养４８ ｈ，测定含各种不同浓度抗生活性物质菌液的吸光度，分析菌株ＣＹ０４生长情况。
２ 结果与分析
２．１ 菌株ＣＹ０４筛选及形态观察
进行细菌单株分离、筛选试验发现菌株ＣＹ０４对金黄色葡萄球菌有较强的拮抗作用。菌株ＣＹ０４革兰氏染色为阳性，产芽孢，其形态特征见图１。细菌大小为０．３～０．５ μｍ×１．５～３.0 μｍ。
２．２ 菌株ＣＹ０４的１６Ｓ ｒＤＮＡ测序结果
以菌株ＣＹ０４的ＤＮＡ为模板进行扩增，获得１．５ ｋｂ左右的特异性片段，将测序结果和ＧｅｎＢａｎｋ已登录的序列进行同源性比对，发现与Ｂａｃｉｌｌｕｓ中多个种的序列具有高度同源性；与Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ同源性最高，达到９９％。
２．３ 菌株ＣＹ０４的系统进化树
选取同源性较高的菌株，以菌株ＣＹ０４的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列用ＭＥＧＡ软件的Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统进化树（图２）。从系统进化树可以看出菌株ＣＹ０４与Ｂａｃｉｌｌｕｓ subtilis细菌遗传距离最近，相似度达到99％，而与Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ距离相对较远。依据形态学和同源性比对结果，判断所分离的活性物质产生菌株ＣＹ０４为Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ。在系统发育地位上属于Ｂａｃｔｅｒｉａ界Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ门 Ｂａｃｉｌｌｉ纲Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科 Ｂａｃｉｌｌｕｓ属Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ种。
２．３ 菌株ＣＹ０４的抑菌活性
采用牛津杯法对菌株ＣＹ０４的抑菌谱试验结果（图３）表明，对革兰氏阴性菌大肠杆菌没有抑制作用，对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌也没有抑制作用，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，其抑菌圈达到１４．２ ｍｍ。说明菌株ＣＹ０４分泌的活性物质主要针对革兰氏阳性菌的某些类群，具有较强的特异性。菌株ＣＹ０４对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌没有拮抗作用，可能是因为ＣＹ０４为芽孢杆菌，其产物不会对同类型菌株产生伤害。
２．４ 菌株ＣＹ０４代谢活性物质产生时期的测定
每隔６ ｈ取样进行抑菌圈测定发现，培养４８ ｈ左右培养液产生的抑菌圈最大，进而可以推断菌株CY04在４８ ｈ左右产生的活性物质最多，其产生活性物质的时间在其生长稳定后期，这与已有的报道一致［１］。
２．５ 菌株ＣＹ０４的抗性
菌株ＣＹ０４的抗性的检测结果（表１）表明，除壮观霉素对菌株ＣＹ０４的最小抑菌浓度达到２０ μｇ／ｍＬ外，其他抗生素的最小抑菌浓度均较低，说明菌株ＣＹ０４对其他抗生活性物质的抗性均较低。一般具有活性物质抗性的细菌在环境中与土著微生物竞争具有一定优势，ＣＹ０４菌株较低的活性物质抗性，不利于其在环境中生存。ＣＹ０４菌株自身产生具有拮抗作用的抗生活性物质，是一种有效防卫机制，使其在种间竞争中战胜其他微生物保存自己。
３ 小结与讨论
微生物杀菌剂具有高效、无污染、不易产生抗药性等特点，因而有广阔的应用前景。枯草芽孢杆菌产生抗菌活性物质已有相关报道［８－１０］。本研究从根际土壤中分离到的细菌菌株ＣＹ０４根据形态学特征以及１６Ｓ ｒＤＮＡ序列比较鉴定为枯草芽孢杆菌。菌株ＣＹ０４对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌没有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较明显，说明ＣＹ０４产生的抗生活性物质具有选择性毒力。进一步研究发现，ＣＹ０４对除壮观霉素外的其他几种抗生素的抗性均较低，表明ＣＹ０４菌株产生抗菌物质，是其能够在环境中生存的有效防卫机制。
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