李 霞，胡侦华，周国林，汪爱华
（武汉市蔬菜科学研究所武汉蔬菜展示中心，４３６４００）
摘要：利用已报道的ＳＲＫ及ＳＬＧ基因序列保守区设计的特异性引物，通过ＰＣＲ 扩增和克隆测序，结合生物信息学分析方法对４份国外引进的不结球白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｓｓｐ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）自交不亲和材料的Ｓ单元型进行分子鉴定。结果表明，不亲和材料Ａ１包含的Ｓ位点基因序列与甘蓝（Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ． ｖａｒ． ｃａｐｉｔａｔａ Ｌ．）ＳＬＧ－３１的相似度为９８％（Ｅ值是０）；不亲和材料Ａ２、Ａ３包含ＣｌａｓｓＩ类及ＣｌａｓｓⅡ类２种Ｓ单元型，Ｓ位点处于杂合状态。不亲和材料Ａ４包含的Ｓ位点基因序列与青花菜（Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ． ｖａｒ． ｉｔａｌｉｃａ Ｐｌｅｎｃｋ）单倍型ＢＯＩ１ ＳＲＫ蛋白基因具有９８ ％的序列相似度，序列覆盖度达９９％。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：不结球白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｓｓｐ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）；自交不亲和；Ｓ单元型；分子鉴定
中图分类号：Ｓ６３４．３；Ｑ３２１＋．７；Ｑ５０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）１６－３９４８－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．１６．０３０
收稿日期：２０１４－１２－１６
基金项目：国家大宗蔬菜产业技术体系项目（ＣＡＲＳ－２５－３０）；武汉市规模设施蔬菜关键技术集成与示范项目（２０１３０２１７０２０１１０５８４）
作者简介：李 霞（１９８１－），女，河南获嘉人，博士，研究方向为小白菜分子育种，（电话）１３２９７０１０３１７（电子信箱）ｌｉｘｉａ＿ｎａｐｕｓ＠１６３．ｃｏｍ；通信作者，
汪爱华，女，高级农艺师，博士，从事蔬菜育种学与生物技术研究，（电子信箱）ｗａｎｇａｉｈｕａｌｔ＠１６３．ｃｏｍ。
白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ．）属十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）芸薹属（Ｂｒａｓｓｉｃａ Ｌ．），原产于中国，栽培历史悠久。其规模无论是面积还是产量，在蔬菜作物中均居首位。不结球白菜，又称小白菜（Ｂ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ． ｓｓｐ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｍａｋｉｎｏ），主要分布在长江流域的中、下游地区，其播种面积约占该地区蔬菜总面积的1/3。白菜为典型的异花授粉作物，杂种优势显著，利用自交不亲和（Ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）系制种是目前最常用的白菜杂交制种技术之一，其主要靠不同单倍型自交不亲和系之间互配来获得，因此对于育种工作者来说，获得自交不亲和系单倍型的快速准确鉴定至关重要。目前普遍采用花期交互授粉的方法进行鉴定，其操作过程繁杂、效率低、准确度不高［１］。快速、准确的鉴定白菜自交不亲和性以及所携带的Ｓ单元型（在遗传上由具有复等位基因的多态性Ｓ位点基因控制的单元类型），不仅可以加速自交亲和系和自交不亲和系的选育进程，而且可以做到有针对性地配制杂交组合、提高育种效率、避免杂交不结实现象发生。
自交不亲和现象是植物在长期进化过程中促进异花授粉、保证物种生存、延续的生殖特性。根据遗传控制不同，显花植物的自交不亲和特性大致可分成配子体自交不亲和（Ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ＧＳＩ）与孢子体自交不亲和（Ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃ ｓｅｌｆ-ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ＳＳＩ）２种类型［２］。配子体自交不亲和是植物界最普遍的一种自交不亲和类型，而孢子体自交不亲和仅存在于十字花科、石竹科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）等植物中。芸薹属是十字花科孢子体控制型的典型代表，研究表明，芸薹属植物自交不亲和性受单位点（Ｓ－ｌｏｃｕｓ）复等位基因（Ｓ１，Ｓ２，……，Ｓｎ）的控制，在白菜自交不亲和研究中已鉴定出１００多种Ｓ单元型［３， ４］。目前，自交不亲和机理研究认为，自交不亲和现象的发生是花粉与柱头乳突细胞间的自我识别引起的，其识别过程主要体现为Ｓ单倍型特异性的受体－配体识别机制，参与这一识别过程的蛋白主要包括：Ｓ位点糖蛋白基因（Ｓ ｌｏｃｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ，ＳＬＧ基因）、Ｓ位点受体激酶基因（Ｓ ｌｏｃｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ，ＳＲＫ基因）、花粉蛋白外壳基因（Ｓ ｌｏｃｕｓ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ，ＳＣＲ基因）。其中ＳＬＧ和ＳＲＫ为柱头表达蛋白基因，ＳＣＲ为花粉壁中存在的特异因子基因，３个紧密连锁的基因参与了花粉和柱头间的相互识别［５－７］。随着分子生物学技术的不断发展及芸薹属植物自交不亲和性的深入研究，若干Ｓ单元型ＳＬＧ、ＳＲＫ和ＳＣＲ基因序列也已确定。随着ＤＮＡ测序技术的飞速发展，通过生物信息学分析，白菜自交不亲和Ｓ单元型分子水平的快速鉴定也已成为可能。
试验利用已公布的ＳＲＫ、ＳＬＧ基因特异引物的ＰＣＲ扩增、克隆测序及生物信息学分析等技术，对４份引进的小白菜自交不亲和材料Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４的Ｓ单元型进行分子鉴定，以期为小白菜杂交组合的授粉配制提供参考依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
参试的不结球白菜自交不亲和材料Ａ１，Ａ２，Ａ３及Ａ４都从国外引进，由武汉市蔬菜科学研究所提供。离心柱型ＰＣＲ产物回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，ｐＭＤ１８－Ｔ载体购于宝生物工程 （大连）有限公司。
１．２ 方法
１．２．１ ＤＮＡ的提取 选取各材料的幼嫩叶片，利用改良的ＣＴＡＢ小样法提取４份试验材料的基因组ＤＮＡ，置于－２０ ℃环境保存备用。
１．２．２ 引物设计 利用已报道的特异性引物ＰＳ５和ＰＳ１５，该引物是由Ｎｉｓｈｉｏ等［８］设计的用于扩增ＣｌａｓｓⅠ类（Ｓ单元型在花粉中表现为显性）ＳＬＧ的引物，特异引物Ｐ３和Ｐ４是张爱芬［９］设计用于扩增ＣｌａｓｓⅡ类（Ｓ单元型在花粉中表现为隐性）ＳＲＫ基因的引物，引物序列见表１，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
１．２．３ ＰＣＲ扩增 分别以４份材料的基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ 反应体系为２０ μＬ。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，５２ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃ 延伸９０ ｓ， ３５个循环； ７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，２５ ℃保存。在１．０％琼脂糖凝胶中进行电泳产物检测，紫外凝胶成像系统拍照。
１．２．４ 目的片段的回收及克隆 利用ＰＣＲ产物回收试剂盒对目的片段进行回收，将回收ＤＮＡ片段连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化到感受态大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）上，进行蓝白斑筛选，对阳性克隆进行ＰＣＲ鉴定。
１．２．５ 测序及序列分析 对于鉴定的阳性克隆送样测序，每个样品测定２～３ 个阳性克隆，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司实施。序列分析利用ＤＮＡｓｔａｒ 软件完成；Ｂｌａｓｔ分析通过ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）在线进行。
２ 结果与分析
２．１ Ｓ单元型相关基因的ＰＣＲ扩增
利用芸薹属ＣｌａｓｓⅠ类Ｓ单元型ＳＬＧ基因特异性引物组合ＰＳ５＋ＰＳ１５及ＣｌａｓｓⅡ类ＳＲＫ基因特异性引物组合Ｐ３＋Ｐ４对４份自交不亲和材料Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４进行ＰＣＲ扩增，结果见图１。从图１可见，Ａ１材料只在ＰＳ５＋ＰＳ１５引物组合中有扩增产物，Ａ４只在Ｐ３＋Ｐ４引物组合中有扩增产物，而Ａ２、Ａ３在２对引物扩增条件下都有特异性条带出现。以上结果表明，Ａ１可能属Ｓ单元型中的ＣｌａｓｓⅠ类，Ａ４则属于ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型。Ａ２和Ａ３的扩增结果表明在这２份不亲和材料中很有可能包括了２类Ｓ单元型，在Ｓ位点表现为杂合类型。为了进一步对以上结果进行验证，对上述４份自交不亲和材料中扩增出的目标片段进行回收，并分别连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，进行大肠杆菌转化，挑取阳性克隆进行序列测定。
２．２ 自交不亲和材料扩增序列的Ｂｌａｓｔ分析
将４份自交不亲和材料扩增产物的ＤＮＡ序列测定结果与ＮＣＢＩ已登录的芸薹属核苷酸序列进行Ｂｌａｓｔ比对，以进一步确定它们的Ｓ单元型。Ｂｌａｓｔ分析表明，自交不亲和材料Ａ１由ＰＳ５＋ＰＳ１５引物所扩增出的１ ３５６ ｂｐ的片段经克隆测序结果比对后发现，其与甘蓝（Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ． ｖａｒ． ｃａｐｉｔａｔａ Ｌ．）ＳＬＧ－３１（ＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ＡＢ０５４７２９．１）在序列覆盖率为９４％的情况下，相似度为９８％（Ｅ值是０）。而与白菜Ｓ位点蛋白１基因（ＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ＨＭ６２９３３８．１）在序列覆盖度为８０％的情况下，与其ＣＤＳ序列相似度达到了９９％（Ｅ值是０）。以上结果显示，自交不亲和材料Ａ１的Ｓ位点基因序列在较高的序列覆盖度情况下，与甘蓝ＳＬＧ－３１具有较高的相似度；而与白菜蛋白基因１所属的Ｓ单元型在较低的序列覆盖度下序列相似度更高。因此，要准确鉴定其Ｓ单元型，需要进一步的试验来验证。
自交不亲和材料Ａ２在２对引物扩增条件下都有扩增条带产生，包括１ ３５６ ｂｐ及１ ０４６ ｂｐ ２条特异性扩增条带。对１ ３９４ ｂｐ的序列进行比对后发现，该序列与白菜的Ｓ位点糖蛋白ＳＬＧ－３０基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号 Ｄ８５２１７．１）及芜菁（Ｂ． ｒａｐａ Ｌ．ｓｓｐ．ｒａｐｉｆｅｒａ Ｍａｔｚｇ）的Ｓ位点受体激酶基因ＳＲＫ－３０ （ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＢ０５４６９３．１）的序列具有很高的相似度，分别为９９％和９８％。因此基本可以确定不亲和材料包含Ｓ３０这一单元型。对１ ０５９ ｂｐ片段的序列比对后发现，其与芜菁ＳＲＫ－６０、ＳＬＧ－６０基因（ＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ＡＢ０９７１１６．１）在覆盖度为９９％的情况下，相似度也高达９９％，远远高于其他单元型，因此可以确定该序列属于Ｓ６０单元型。所以自交不亲和材料Ａ２基本上可以确定其具备Ｓ３０、Ｓ６０这２种Ｓ单元型，再一次证明自交不亲和材料Ａ２在Ｓ位点为杂合状态。
自交不亲和材料Ａ３也如Ａ２材料，在ＣｌａｓｓⅠ类及ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型引物中都扩增出了对应的目的条带，分别为１ ３５６ ｂｐ及１ ０４６ ｂｐ。对２条序列的分析结果表明，前者与萝卜（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）ＳGＴ-６３基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＥＦ０５６４９９．１）在序列覆盖率为９８％的条件下，序列相似度为９９％；后者则与青花菜（Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ． ｖａｒ． ｉｔａｌｉｃａ Ｐｌｅｎｃｋ）单倍型ＢＯＩ１ ＳＲＫ蛋白基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＪＱ２５３７８５．１）具有９８％的序列相似度，序列覆盖度达９９％。以上结果表明，不亲和材料Ａ３在Ｓ位点也证实为杂合状态。
自交不亲和材料Ａ４属于ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型，对其１ ０４６ ｂｐ片段的序列分析结果（图２）表明，自交不亲和材料Ａ４所包含的ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ位点基因序列与自交不亲和材料Ａ３中的Ｓ位点基因序列一致，２个材料应包含同一类型的Ｓ基因。
３ 讨论
白菜为典型的异花授粉作物，杂种优势显著。利用自交不亲和系制种，主要靠不同单倍型自交不亲和系之间的互配来获得，因此对于育种工作者来说，获得自交不亲和系单倍型的快速鉴定至关重要。目前已有很多鉴定自交不亲和性的方法，主要包括：亲和指数法［１０］、荧光显微法［１１］、等电点聚焦电泳法［１２］、免疫测定法［１３］、ＲＦＬＰ－ＰＣＲ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，限制性片段长度多态性－聚合酶链式反应）分子鉴定法［９］。以上方法难以对所研究材料进行准确的Ｓ单元型鉴定。随着ＤＮＡ测序技术的迅速发展，以及公开报道的Ｓ单元型序列的增多，使得通过ＰＣＲ扩增后直接测序来判定自交不亲和材料的Ｓ单元型成为可能。分子鉴定法能够实现早期对植株自交不亲和性Ｓ单元型的鉴定，从而大大提高了检测效率，避免了杂交不结实现象的发生，具有非常广阔的应用前景。本研究利用ＳＬＧ及ＳＲＫ基因的保守序列设计的引物，对４份不结球白菜进行了Ｓ单元型的分子鉴定，结果表明，该方法基本可以鉴定出４份材料的Ｓ单元型类型，其中发现ＣｌａｓｓⅠ类和ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型同时出现在自交不亲和材料Ａ２和Ａ３中，这种现象在前人的研究中也有相关的报道。张爱芬［９］对１６份不结球白菜材料Ｓ单元型的鉴定中，发现有１１份材料同时扩增出ＣｌａｓｓⅠ类和ＣｌａｓｓⅡ类２种类型，自交不亲和Ｓ位点处于杂合状态；这种现象也曾在白菜的一些自交不亲和系中出现过，其原因可能是由于其自交不亲和性导致其自我结实困难、而外来花粉在繁殖过程中又极易侵入、造成在表型上很难加以区分基因位点的杂合与否所产生的［１４］；因此，出现了很多亲本材料在Ｓ位点上并不是完全纯合的现象。所以在进行新的不亲和种质资源引进及繁殖不亲和材料时，应该严防外来花粉的侵入，做好隔离措施，以保证其纯度，同时辅以分子技术手段快速实现其Ｓ单元型的鉴定，从而提高不亲和材料系的选育及组合选配效率。
此外，在对４份白菜自交不亲和材料的Ｓ单元型鉴定的过程中还发现，在做Ｓ位点基因序列分析时，其中大部分序列与甘蓝、萝卜等其他十字花科作物中所包含的的Ｓ位点基因序列表现出了极高的相似度。例如，在自交不亲和材料Ａ３中其１ ３５６ ｂｐ片段的序列分析结果表明，Ａ３与萝卜Ｓ位点糖蛋白SGT-６３基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＥＦ０５６４９９．１）在序列覆盖度为９８％的条件下，序列相似度为９９％；而自交不亲和材料Ａ４所包含的Ｓ基因序列与青花菜单倍型ＢＯＩ１ ＳＲＫ蛋白基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＪＱ２５３７８５．１）具有９８％的序列相似性，序列覆盖度达９９％。在十字花科不亲和研究中，通过比较基因组研究发现，青花菜和芜菁的Ｓ位点基因具有高度的相似性，白菜中Ｓ单倍型Ｓ４６、Ｓ４７、Ｓ８分别和甘蓝的３种Ｓ单倍型Ｓ７、Ｓ１２、Ｓ３２在ＳＲＫ基因方面均有高度的相似性，种间杂交发现它们之间也表现出相同的自交不亲和识别特异性［１５］。同样萝卜属（Ｒａｐｈａｎｕｓ Ｌ．）作物萝卜也具有和芸薹属作物高度同源的ＳＬＧ、ＳＲＫ和ＳＰ１１基因，经过核酸序列的聚类分析并不能将两者分开。这些数据表明，十字花科Ｓ位点基因的多态性在芸薹属和萝卜属分化成不同的种属以前已经形成，并很可能来自于共同的祖先［１６］。本研究中，４份自交不亲和材料所包含的几种Ｓ单元型，从基因组序列分析的结果来看，与甘蓝及萝卜中的一些Ｓ位点基因序列相似度很高，是不是具有相同的识别特异性，还有待进一步通过试验来证实。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 高启国，韦静宜，朱利泉，等．基于ＳＲＫ和ＳＣＲ序列的甘蓝自交不亲和系单倍型分析［Ｊ］．西南大学学报（自然科学版），２０１１，３３（２）：１－５．
［２］ ＤＥ ＮＥＴＴＡＮＣＯＵＲＴ Ｄ．Ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ［Ｍ］． Ｂｅｒｌｉｎ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９７７． ２３０．
［３］ ＢＡＴＥＭＡＮ Ａ Ｊ． Ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ ＩＩＩ． Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ ［Ｊ］． Ｈｅｒｅｄｉｔｙ， １９５５， ９： ５３－５８．
［４］ ＮＯＵ Ｉ Ｓ， ＷＡＴＡＮＡＢＥ Ｍ， ＩＳＯＧＡＩ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓ－ａｌｌｅｌｅｓ ａｎｄ Ｓ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｉｎ Ｔｕｒｋｅｙ ａｎｄ Ｊａｐａｎ［Ｊ］．Ｓｅｘ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ，１９９３，６： ７９－８６．
［５］ ＳＴＯＮＥ Ｓ Ｌ，ＡＲＮＯＬＤＯ Ｍ，ＣＯＲＩＮＧ Ｄ Ｒ． Ａ ｂｒｅａｋ ｄｏｗｎ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ＡＲＣＩ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８６：１７２９－１７３１．
［６］ ＳＩＬＶＡ Ｎ Ｆ，ＧＯＲＩＮＧ Ｄ Ｒ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，５８：１９８８－２００７．
［７］ ＴＡＫＡＹＡＭＡ Ｓ，ＩＳＯＧＡＩ Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，２００３，５４： １４９－１５６．
［８］ ＮＩＳＨＩＯ Ｔ，ＫＵＳＡＢＡ Ｍ， ＷＡＴＡＮＡＢＥ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ． ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｉｚｅｓ ｏｆ ＳＬＧｓ［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９９６，９２：３８８－３９４．
［９］ 张爱芬．不结球白菜自交不亲和相关基因克隆和Ｓ单元型的鉴定［Ｄ］．南京：南京农业大学，２００９．
［１０］ 方智远，孙培田，刘玉梅．甘蓝杂种优势利用和自交不亲和系选育的几个问题［Ｊ］.中国农业科学，１９８３（３）：５１－６１．
［１１］ ＧＥＯＲＧＩＡ Ａ Ｖ Ｓ，ＯＣＫＥＮＤＯＮ Ｄ，ＧＡＢＲＩＥＬＳＯＮ Ｒ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ Ｂｒｏｃｃｏｌｉ． ＪＤ［Ｊ］． Ｈｏｒｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８２， １７（５）： ７４８－７４９．
［１２］ ＮＩＳＨＩＯ Ｔ， ＨＩＮＡＴＡ Ｋ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｔｉｇｍａ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ． ｂｙ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ ［Ｊ］． Ｈｅｒｅｄｉｔｙ， １９７７， ３８： ３９１－３９６．
［１３］ ＣＨＡＢＬＥ Ｖ Ｒ， ＨＥＲＶＥ Ｙ， ＤＵＭＡＳ Ｃ ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ－ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ． Ｐａｒｔ １． Ｉｎ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｏｆ ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ （Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ ｂｏｔｒｙｔｉｓ）［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９９７， ９４： ３３８ －３４６．
［１４］ ＮＡＳＲＡＬＬＡＬＬ Ｊ Ｂ， ＮＡＳＲＡＬＬＡＨ Ｍ Ｅ． Ｐｏｌｌｅｎ－ｓｔｉｇｍａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １９９３， ５： １３２５－１３３５．
［１５］ ＫＩＭＵＲＡ Ｒ， ＳＡＴＯ Ｋ， ＦＵＪＩＭＯＴＯ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｍａｉｎｉａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒａｌ， ２００２， ２９： ２１５－２２３．
［１６］ ＯＫＡＭＯＴＯ Ｓ， ＳＡＴＯ Ｙ， ＳＡＫＡＭＯＴＯ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｍｉｌａｒ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ（Ｓ） ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｅｒａ，Ｒａｐｈａｎｕｓ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｅａ［Ｊ］． Ｓｅｘ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ， ２００４， １７： ３３－４０．