陆宁海，吴利民，郎剑锋，霍云凤，石明旺
（河南科技学院资环学院植保系， 河南 新乡 ４５３００３）
摘要：２０１３年从河南省４个地区采集玉米小斑病标样，对分离出的１４０个玉米小斑病菌菌株进行了生理小种鉴定和群体结构分析。结果表明，河南省玉米小斑病菌有Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｏ等４种生理小种，但各小种在地区间的分布存在差异，其中，Ｏ小种是河南省各玉米产区小斑病菌的优势小种，且在豫南分布最广泛，其次是Ｃ小种和Ｓ小种，Ｔ小种的比例最小。Ｏ小种具有不同致病力，强致病力菌株的出现频率较弱致病力菌株高，强致病力菌株主要分布在豫南地区，弱致病力菌株主要分布在豫北地区。
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关键词 ：玉米小斑病菌（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｍａｙｄｉｓ）；生理小种；鉴定；致病力
中图分类号：Ｓ４３５．１３１．４＋９ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1603-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.018
玉米小斑病为我国玉米产区重要病害之一，在黄河和长江流域的温暖潮湿地区发生普遍而严重［１，２］。近几年，由于抗病品种的单一化大面积种植以及全球气候的变暖，玉米小斑病逐渐成为河南省玉米生产中的重要病害之一，一般造成减产１５％～２０％，严重的减产达５０％以上，甚至无收。小斑病菌有明显的生理分化现象，鉴于玉米品种的细胞质类型分为Ｔ型、Ｃ型、Ｓ型和正常Ｎ型４种，按照对不同细胞质的专化性，通常把小斑病菌也分为Ｔ、Ｃ、Ｓ和Ｏ等４个小种。２０世纪７０年代，国际上报道玉米小斑病的Ｏ、Ｔ两个小种［３，４］，我国于１９７４年提出玉米小斑病菌存在生理分化现象。１９７９年朱贤朝等［５］提出我国的玉米小斑病菌存在与美国类似的Ｏ、Ｔ这两个生理小种，并且认为Ｔ型小种在我国广泛存在。１９８１年罗畔池等［６］提出将中国的玉米小斑病菌划分为１６个生理小种。１９８２年黄梧芳等［７］将我国的玉米小斑病菌分为６个小种，１９８9年魏建昆等［8］证实中国存在Ｃ小种。２００５年孔令晓等［9］鉴定了河北省玉米小斑病菌生理小种，２０１０年王利智等［10］对云南玉米小斑病菌生理小种进行了鉴定，研究表明玉米小斑病菌生理小种Ｏ、Ｃ、Ｓ和Ｔ小种均有分布，Ｏ小种是优势小种。河南省玉米栽培面积大，小斑病发生严重，有关病菌生理小种的组成和结构目前还不清楚。为了指导玉米抗病育种和品种布局，本研究开展了河南省玉米小斑病菌生理小种的鉴定研究及群体结构分析。
１ 材料与方法
１．１ 病原菌的采集与分离
２０１３年采集了河南省豫北、豫南、豫西和豫东４个地区的玉米小斑病病叶标本，采用组织分离和保湿培养的方法，在双目扩大镜下分离单孢菌株，共获得１４０个玉米小斑病菌株．
１．２ 鉴别寄主
分别为含有Ｃ、Ｓ、Ｔ型细胞质和正常细胞质的４份同核Ｃ１０３自交系，即Ｃ１０３Ｃ、Ｃ１０３Ｓ、Ｃ１０３Ｔ和Ｃ１０３Ｎ，由河南科技学院玉米研究所提供。
１．３ 生理小种鉴定
将从各地采集分离到的玉米小斑病菌菌株接种在ＰＤＡ斜面培养基上培养，待产孢时，进行单胞分离。将经单孢纯化的小斑病菌接在ＰＤＡ＋玉米汁液培养基上，于２５ ℃培养箱内培养。将具有Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｎ不同细胞质的鉴别寄主分别播种于花盆内，每盆１５粒种子，保苗１０株。待玉米长到４～５叶期，将在ＰＤＡ＋玉米汁液培养基上培养１０ ｄ的玉米小斑病菌加入少量含５‰吐温-２０的无菌水刮洗，双层纱布过滤，配成浓度为１×１０４/ｍＬ的孢子悬浮液，用喷雾器喷雾接种。接种后，将育苗盘移入２５ ℃、相对湿度９０％以上的接种室中，保持黑暗２４ ｈ后，转入同一温室接受自然光照。４～７ ｄ后调查发病情况，测量病斑大小，记载病斑类型，确定生理小种类型。
１．４ 鉴定标准
小种命名及致病力强弱标准参照孔令晓等［９］的方法。玉米小斑病病斑类型分为萎蔫型病斑和坏死型病斑，每一类型细胞质玉米调查２５个病斑，分别测量病斑的长和宽，计算平均值。
Ｔ小种：在Ｔ型细胞质不育系上，病原菌所致的病斑为萎蔫型病斑，病斑的长和宽明显大于在Ｃ、Ｓ型细胞质不育系和正常细胞质自交系上的病斑。
Ｃ小种：在Ｃ型细胞质不育系上，病原菌所致的病斑为萎蔫型病斑，病斑的长和宽明显大于在Ｔ、Ｓ型细胞质不育系和正常细胞质自交系上的病斑。
Ｓ型菌株（对Ｓ型细胞质致病力强的菌株）：Ｓ型细胞质不育系上，病原菌所致的病斑为萎蔫型病斑，病斑的长和宽明显大于在Ｔ、Ｃ型细胞质不育系和正常细胞质自交系上的病斑。
Ｏ小种：在正常细胞质自交系上，病原菌所致的病斑为萎蔫型病斑，病斑的长和宽明显大于在Ｔ、Ｃ、Ｓ型细胞质不育系上的病斑，或在Ｔ、Ｃ、Ｓ型细胞质不育系上的病斑和在正常细胞质自交系上的病斑大小差异不明显。
强致病力菌株：在Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｎ不同细胞质的鉴别寄主叶片上所致的平均病斑长度大于或等于６ ｍｍ。
中致病力菌株：在Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｎ不同细胞质的鉴别寄主叶片上所致的平均病斑长度大于或等于４ ｍｍ，小于６ ｍｍ。
弱致病力菌株：在Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｎ不同细胞质的鉴别寄主叶片上所致的平均病斑长度小于４ ｍｍ。
２ 结果与分析
２．１ 河南省玉米小斑病菌生理小种分布
对１４０个河南省玉米小斑病菌菌株进行了生理小种的鉴定，由表１可以看出，河南省玉米小斑病菌有Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｏ等４种生理小种，其中Ｏ小种的数量为６６个，分离频率为４７．１％，Ｃ小种的数量为３１个，分离频率为２２．１％，Ｓ小种的数量为２８个，分离频率为２０．０％，Ｔ小种的数量为１５个，分离频率为１０．７％。由此可见，Ｏ小种是河南省各玉米产区小斑病菌的优势小种，其次是Ｃ小种和Ｓ小种，Ｔ小种的比例最小。
从４种生理小种在豫东、豫西、豫南、豫北的分布数据分析可以看出，各小种在地区间的分布存在差异，Ｏ小种在豫南分布最广泛，分离频率为５６．１％，其次是豫北和豫西，分离频率分别为４８．６％和４３．３％，在豫东分布相对较少，分离频率为３７．５％；Ｓ小种在豫北分布最广泛，分离频率为２７．０％，其次是豫西和豫南，分离频率分别为２０．０％和１９．５％，在豫东分布相对较少，分离频率为１２．５％；Ｃ小种在豫东分布最广泛，分离频率为３４．４％，其次是豫西，分离频率为２６．７％，在豫南和豫北分布相对较少，分离频率分别为１７．１％和１３．５％；Ｔ小种在豫东分布最广泛，分离频率为１５．６％，其次是豫西和豫北，分离频率分别为１０．０％和１０．８％，在豫南分布相对较少，分离频率为７．１％。
２．２ 河南省玉米小斑病菌Ｏ小种致病力变化和分布
由表２可以看出，河南省玉米小斑病菌优势小种Ｏ小种具有不同的致病能力，强致病力菌株出现频率为３３．３％，中致病力菌株出现频率为４７．０％，弱致病力菌株出现频率为１９．７％，因此，目前优势群体为中致病力菌株群体。Ｏ小种不同致病能力的菌株在不同地区之间也存在一定的差异，强致病力菌株在豫南地区出现频率相对较高，出现频率为３４．８％，在豫西地区出现频率最低；中致病力菌株在豫西地区出现频率相对较高，出现频率为５３．８％，在豫南地区出现频率最低；弱致病力菌株在豫北地区出现频率相对较高，出现频率为２２．２％，在豫西地区出现频率最低。
３ 小结与讨论
对河南省玉米小斑病菌生理小种进行分析，结果表明生理小种主要有Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｏ等４种，Ｏ小种的分离频率高达４７．１％，是河南省各玉米产区小斑病菌的优势小种。这一结论与孔令晓［９］、王利智［１０］和邱小燕［１１］玉米小斑病菌生理小种的研究结论一致，由此说明Ｏ小种是我国玉米小斑病菌的优势小种，仍然是抗病育种工作的主要研究对象。
从４种生理小种在豫东、豫西、豫南、豫北的分布数据分析可以看出，各小种在地区间的分布存在差异，Ｏ小种在豫南分布最广泛，其次是豫北和豫西，在豫东分布相对较少；Ｓ小种在豫北分布最广泛，其次是豫西和豫南，在豫东分布相对较少；Ｃ小种在豫东分布最广泛，其次是豫西，在豫南和豫北分布相对较少；Ｔ小种在豫东分布最广泛，其次是豫西和豫北，在豫南分布相对较少。造成这种现象的原因可能有两个，一是与各地种植玉米的品种差异，以及玉米栽培方式有关系，由于某一细胞质类型的玉米种质有可能在某些地区长期种植，导致病原菌对某一种细胞质有专化性的生理小种出现频率上升［１２］；二是可能与各地的气候条件有关系，不同的气候条件对病原菌寄生适合度有影响，某个小种对当地的环境条件适合度较高，其出现频率就可能高，对当地气候条件适合度较低的生理小种，其出现频率就可能低［１３］。因此各地区应考虑和针对不同的生理小种选育和种植抗病品种，并进行品种合理布局。在年度间，河南省玉米小斑病菌生理小种组成变化的趋势为，Ｏ小种出现频率先降低再逐步升高，Ｓ小种出现频率逐年增加，Ｃ小种出现频率逐年减少，Ｔ小种出现频率先增加然后逐年减少。出现这种现象的原因可能与当年不同细胞质类型的玉米品种栽培面积和布局有关系，导致病原菌对某一种细胞质有专化性的生理小种出现频率上升，另外可能与当年的气候条件有关系，影响病原菌不同生理小种的自然寄生适合度，适合度较高的小种出现频率可能较高［１４］。
河南省玉米小斑病优势小种Ｏ小种具有不同致病力，强致病力菌株和中致病力菌株的出现频率较弱致病力菌株高，强致病力菌株主要分布在豫南地区，弱致病力菌株主要分布在豫北地区，说明Ｏ小种的生物学特性在改变，更适合温度高、湿度高的环境条件，应引起当地育种和生产部门的重视。
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