袁进成１，程校云２，姚志刚１，龚学臣１，王凌云１
（１．河北北方学院，河北 张家口 ０７５０００；２． 河北省怀来县农业局，河北 怀来 ０７５１３１）
摘要：赤峰显性核不育谷子是在谷子中首次发现的核不育材料，该材料的育性受２对核显性基因互作控制，一对是显性核不育基因Ｍｓｃｈ，另一对是显性上位育性恢复基因Ｒｆ。两者共同存在时显性上位育性恢复基因Ｒｆ能抑制显性核不育基因Ｍｓｃｈ的表达，从而表现可育。利用已构建的不育基因Ｍｓｃｈ的上位育性恢复基因Ｒｆ的近等基因系（ＮＩＬｓ）为材料，通过对３００对ＡＦＬＰ引物组合进行筛选，找到了与显性上位育性恢复基因Ｒｆ紧密连锁的２个ＡＦＬＰ标记（Ｅ１５／Ｍ５２和Ｅ２０／Ｍ４１），与不育基因的遗传距离分别是７．０ ｃＭ和１２．７ ｃＭ，而且位于不育基因的同一侧，标记间相距５．７ ｃＭ。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：谷子（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）；显性上位育性恢复基因；ＡＦＬＰ标记
中图分类号：Ｓ５１５；Ｑ７８９ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０７－１５４７－０５
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０７．００３
雄性不育性在植物界普遍存在，迄今为止，已经在６００多个物种及种间杂种中发现了雄性不育，其中包括玉米、水稻、大麦、谷子、高粱、油菜、棉花等主要农作物［１］。细胞核雄性不育（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）是由核基因控制的自然界最常见的雄性不育现象，人们已经在玉米、棉花、谷子、水稻、大豆、小麦、油菜和大白菜等许多作物上发现和诱导出这种雄性不育类型。在核不育材料中多数是由隐性基因控制的，由显性基因控制的核不育现象较少，国内外曾在棉花、莴苣、红胡麻草、马铃薯、小麦、亚麻等少数植物中发现过［２－４］。谷子（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）核基因互作型雄性不育是胡洪凯等［５，６］1９７８年首次从澳大利亚谷×吐鲁番谷杂交后代中发现的，研究证实该材料的不育性受１对核显性基因控制，并定名为赤峰显性核不育，将该不育基因命名为Ｍｓｃｈ。进一步的研究表明，这份显性雄性不育材料具有其特殊性，表现在：①它的杂合不育株和纯合不育株的花药内有部分正常可育花粉，在北方谷子产区花药始终不开裂不散粉，自交不结实；但在特定短日照的生态条件下（如冬季在低纬度的海南三亚、通什和广东湛江等地）则花药部分开裂，能产生６．０％～１０．０％的自交种子，可以获得纯合的全不育群体［７］；②经过大量的测配，从它的姊妹系中发现了恢复源材料１８１－５，１８１－５携带的显性育性恢复基因Ｒｆ可以抑制杂交种中显性不育基因的表达，使育性恢复正常［５］。基于这些特点，有学者建立起一套特殊的“三系”制种体系，巧妙地解决了杂种优势利用中不育系繁种、育性恢复等问题，为作物杂种优势的利用开辟了一条新路，也进一步丰富了杂种优势利用的理论基础［８］。
为了更有效地利用这种双显性基因控制的不育性来配制谷子杂交种，作者找到了２个与不育基因Ｍｓｃｈ紧密连锁的ＡＦＬＰ标记Ｐ１７／Ｍ３７和Ｐ３５／Ｍ５２，其与不育基因Ｍｓｃｈ的遗传距离分别为２．１ ｃＭ和１．４ ｃＭ，是分布于不育基因同一侧的ＡＦＬＰ标记，这２个标记间的遗传距离为０．７ ｃＭ［９］。本试验在此基础上利用ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）技术，通过１对近等基因系，寻找与抑制谷子核不育基因Ｍｓｃｈ表达的显性育性恢复基因Ｒｆ紧密连锁的分子标记，可以快速、准确、有效地鉴定杂种后代的基因型，指导杂种优势利用于育种实践，将优异基因转移到更多的不同遗传背景的育种材料中，同时也可以为雄性不育基因的克隆，不同作物雄性不育特性的比较基因组学研究提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料
用于研究的材料有近等基因系ｍｓｍｓｒｆｒｆ和ｍｓｍｓＲｆＲｆ（图１）及Ｆ2的３∶１（Ｒｆ∶ｒｆｒｆ）群体（图２）。研究材料种植在试验田和温室，苗期（７叶）随机选取近等基因系各５株和３∶１群体３００株，以单株为单位分别编号挂牌，然后按编号取单株嫩叶提取基因组总ＤＮＡ。开花前各单株分别与同期播种基因型为ＭｓＭｓｒｆｒｆ的纯合不育系株穗套在一个袋内作测交，海南种植杂种后代的种子，通过育性来判断各单株是否含有显性基因Ｒｆ。
１．２ 显性育性恢复基因Ｒｆ的表型鉴定
由杂合不育株Ｍｓｍｓｒｆｒｆ与恢复系１８１－５（ｍｓｍｓＲｆＲｆ）杂交获得Ｆ１，Ｆ１自交选其不育株再用恢复系１８１－５回交，后代再自交。这样连续回交５代，最后获得了恢复系１８１－５（ｍｓｍｓＲｆＲｆ）的近等基因系ｍｓｍｓｒｆｒｆ（图１）。
近等基因系苗期各取５株用于ＤＮＡ的提取，把含有Ｒｆ恢复基因的５个单株基因组ＤＮＡ等量混合构成恢复池，把不含恢复基因的５个单株基因组ＤＮＡ等量混合构成不恢池。３∶１群体是由杂合不育系（Ｍｓｃｈｍｓｒｆｒｆ）与恢复系１８１－５（ｍｓｍｓＲｆＲｆ）杂交获得的Ｆ２群体（图２），该Ｆ２群体２００８年在中国农业科学院院内试验田种植，抽穗期随机选取３００个Ｆ２单株穗与纯合不育系（ＭｓｃｈＭｓｃｈｒｆｒｆ）的株穗套在一个袋内作测交，同时取这３００个Ｆ２单株的叶片用于ＤＮＡ提取。收获期，套在一个袋里的２个单株若都结种，收获不育株上的测交种，在海南种植，每穗一行，根据穗行的育性分离情况来确定Ｆ２单株是否含有Ｒｆ基因。测交后代在海南全可育或育性有分离的株行对应的Ｆ２单株是含有显性上位基因Ｒｆ，而测交后代全不育的株行对应的Ｆ２单株和套在一个袋里的２个不结实穗的Ｆ２单株是基因ｒｆ（图２）。参照Ｓａｇｈａｉ－Ｍａｒｏｏｆ等［１０］的ＣＴＡＢ法抽提并纯化ＤＮＡ。
１．３ ＡＦＬＰ分析
ＡＦＬＰ分析程序参照Ｚａｂｅａｕ和Ｖｏｓ发明的方法。ＡＦＬＰ酶切采用ＥｃｏＲⅠ和ＭｓｅⅠ双酶切组合。内切酶和Ｔ４连接酶购自ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）公司，接头、引物及其他试剂购自上海博亚生物技术公司，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。选扩采用Ｅ＋２／Ｍ＋３和Ｅ＋３／Ｍ＋３引物组合。扩增产物在６％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染显色观察。首先对近等基因系进行分子检测，寻找多态性，对于在１对近等基因系之间有多态性的引物组合，进一步用３∶１群体检测其与目标性状的连锁遗传关系。
１．４ 数据分析
结果记录有带计为１，无带计为０。数据处理用Ｍａｐｍａｋｅｒ ＥＸＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０软件进行。
２ 结果与分析
２．１ 显性恢复基因Ｒｆ的鉴定
２００８年冬天在海南种植测交种，每穗一行，收获期观察育性。如果穗行出现育性分离或全可育，表明这个穗行的父本含有抑制不育基因Ｍｓｃｈ表达的显性恢复基因Ｒｆ，若穗行全不育表明其父本不含有显性恢复基因Ｒｆ（图２）。从图２不难看出Ｒｆ∶ｒｆｒｆ的理论比率为３∶１。本试验在试验田里随机选取３００个单株穗与纯合不育系（ＭｓｃｈＭｓｃｈｒｆｒｆ）的株穗套在一个袋内作测交，共收获了２４１株测交种，不育株是５９株。在海南种植的２４１个株行中，全可育和育性分离的株行有２２２行，全不育的有１９行，含显性不育恢复基因的植株与不含有恢复基因的植株的比率为２２２∶７８（１９＋５９），符合３∶１的规律。
２．２ 与不育基因Ｍｓｃｈ的恢复基因Ｒｆ连锁的ＡＦＬＰ标记
用近等基因系（ｍｓｍｓＲｆＲｆ、ｍｓｍｓｒｆｒｆ）ＤＮＡ池对３００对引物组合进行筛选，发现每个引物组合均可扩增出稳定、清晰的条带，每对引物约能扩出清晰的５０条带，扩增片段长度５０～１ ０００ ｂｐ。其中，有３６对引物组合的扩增产物在近等基因系间表现出多态性，用３∶１群体的部分单株对以上引物组合进一步筛选，结果发现只有Ｅ１５／Ｍ５２和Ｅ２０／Ｍ４１与恢复基因Ｒｆ紧密连锁，且分别扩出２４０ ｂｐ和２２０ ｂｐ的片段（图３、图４）。对于连锁较紧密的标记Ｅ１５／Ｍ５２和Ｅ２０／Ｍ４１，用１６８株３∶１群体进行单株ＰＣＲ检测。将分子标记和田间表型的统计数据利用Ｍａｐｍａｋｅｒ ３．０软件进行计算与分析，结果表明标记Ｅ１５／Ｍ５２和Ｅ２０／Ｍ４１与Ｒｆ基因的遗传距离分别为７．０ ｃＭ和１２．７ ｃＭ，分布于Ｒｆ基因的同一侧，这２个标记间的遗传距离为５．７ ｃＭ（图５）。
３ 讨论
雄性不育是杂种优势利用的基础，是实现谷子杂种优势利用最经济、有效的途径之一［7,11-13］。谷子核基因互作型雄性不育的不育性受两对显性核基因（不育基因Ｍｓｃｈ和上位育性恢复基因Ｒｆ）互作控制［５，６］，恢复基因通过显性上位作用来抑制不育基因的表达从而恢复育性，起到恢复基因的作用。这种由双显性基因互作控制的雄性核不育材料的发现为谷子杂种优势利用提供了一条全新的途经［８］，但同时也应注意到由于谷子中的双显性基因控制的雄性不育性有它自己的特点，若将不育基因转移到不同的优良遗传背景中以及进行必要的细胞质转化，其转育工作十分艰难与缓慢。以前作者找到的2个与不育基因紧密连锁、分布于不育基因同一侧的ＡＦＬＰ标记，与目标基因之间的距离比较近（２．１ ｃＭ 和１．４ ｃＭ）［９］，可快速鉴定转育后代，加速不育系的选育进程，有助于谷子显性核不育材料在育种中得到更加快捷、有效、广泛的应用。本研究在此基础上找到了２个与控制不育基因Ｍｓｃｈ的上位恢复基因Ｒｆ连锁、分布于上位恢复基因Ｒｆ的同一侧的ＡＦＬＰ标记，与目标基因之间的距离分别是７．０ ｃＭ 和１２．７ ｃＭ，尽管距离比较远，但在辅助杂种配置方面可以得到广泛的应用。利用此标记，可更加有效地把显性上位育性恢复基因转移到遗传基础优良的品系中，培育新的优良恢复系，还可以以它为桥梁通过连续回交和聚合杂交的方式，聚合有利基因，创制新的优良谷子新品系，进一步丰富谷子的种质资源。
众所周知，对于由２对显性基因控制的雄性不育的机制，有２种假说；一是核基因互作假说，一是复等位基因假说。核基因互作假说［14］认为，不育性由２对核基因控制，显性核不育基因Ｍｓ对隐性可育基因ｍｓ为完全显性，显性抑制基因Ｒｆ对非抑制基因ｒｆ为完全显性，不育株有ＭｓＭｓｒｆｒｆ和Ｍｓｍｓｒｆｒｆ ２种基因型，可育株有７种基因型（ＭｓＭｓＲｆＲｆ、ＭｓＭｓＲｆｒｆ、ＭｓｍｓＲｆＲｆ、ＭｓｍｓＲｆｒｆ、ｍｓｍｓＲｆＲｆ、ｍｓｍｓＲｆｒｆ和ｍｓｍｓｒｆｒｆ）。复等位基因假说［１5］认为，在控制育性的位点上有Ｍｓｆ、Ｍｓ和ｍｓ３个复等位基因，Ｍｓｆ为显性恢复基因，Ｍｓ为显性不育基因，ｍｓ为隐性可育基因，三者之间的显隐性关系为Ｍｓｆ＞Ｍｓ＞ｍｓ。
不育株有２种基因型ＭｓＭｓ和Ｍｓｍｓ，可育株有４种基因型ＭｓｆＭｓｆ、ＭｓｆＭｓ、Ｍｓｆｍｓ和ｍｓｍｓ。
通过遗传学的分离比例来确定是否是显性上位互作或是复等位基因［５］，赤峰显性核不育谷子在遗传学上已被证明了是显性上位互作来控制的雄性不育性［６］。为了提供更加有利、可靠的分子证据，利用谷子ＡＦＬＰ图谱，将不育基因Ｍｓ和上位恢复基因Ｒｆ定位于染色体上，看它们是被定为在同一位点上还是不同位点，从而来判断它们是上位互作基因还是复等位基因。同时，克隆这些基因，进一步去阐明谷子双显性基因控制的不育性的遗传机制。
赤峰显性核不育谷子的这种双显性基因控制的雄性不育性与萍乡显性核不育水稻的育性控制有许多相似之处［６］，可以把这２种机制合并研究，来确定植物之间这种控制育性的相同机理；也可以通过比较谷子、水稻与其他植物上双显性基因控制的不育性的遗传机制的异同点，来确定不同植物之间的不同发育特性，从而进一步完善双显性基因控制的不育性的遗传机制的理论基础，将会更有利于杂种优势的利用。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 刘秉华．作物显性雄性不育基因分类与起源的探讨［Ｊ］．遗传，１９９３，１５（６）：３２-３４．
［２］ ＡＬＬＩＳＯＮ Ｄ Ｃ， ＦＩＳＨＥＲ Ｗ Ｄ． Ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｉｎ ｕｐｌａｎｄ ｃｏｔｔｏｎ［Ｊ］． Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ， １９６４， ４： ５４８－５４９．
［３］ ＲＹＤＥＲ Ｅ Ｊ． Ａｎ ｅｐｉｓｔａｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｌｌｅｎ ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｎ ｌｅｔｔｕｃｅ（Ｌａｃｔｕｃａ Ｓａｔｉｖａ Ｌ．）［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｈｏｒｔ Ｓｃｉ， １９６３， ８３：５８５－５９８．
［４］ 邓景扬，高忠丽．太谷核不育小麦的发现和鉴定［Ｊ］．作物学报，１９８０，６（２）：８５－９８．
［５］ 胡洪凯，马尚耀，石艳华．谷子显性雄性不育基因的发现［Ｊ］．作物学报，１９８６，１２（２）：７３－７８．
［６］ 胡洪凯，石艳华，王朝斌，等．“Ｃｈ型”谷子显性核不育的遗传及其应用研究［Ｊ］．作物学报，１９９３，１９（３）：２０８－２１７．
［７］ 王天宇，杜瑞恒．谷子高度雄性不育基因在常规品种选育中的应用［Ｊ］．华北农学报，１９９４，９（２）：２１－２５
［８］ 刘秉华．作物改良理论与方法［M］．北京：中国农业科学技术出版社，２００１．
［９］ 袁进成，石云素，胡洪凯．谷子显性雄性不育基因Ｍｓｃｈ的ＡＦＬＰ标记［Ｊ］．作物学报，２００５，３１（１０）：１２９５－１２９９．
［１０］ ＳＡＧＨＡＩ－ＭＡＲＯＯＦ Ｍ Ａ，ＳＯＬＩＭＡＮ Ｋ Ｍ，ＪＯＲＧＥＮＳＥＮ Ｒ Ａ． Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｓｐａｃｅｒ－ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｂａｒｌｅｙ：Ｍｉｂｏｓｏｍａｌ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ， ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９８４，８１：８０１４－８０１８．
［１１］ 崔文生，杜 贵，赵治海．谷子光敏型显性核不育材料选育［Ｊ］． 中国农业科学，１９７９，１２（１）：４３－４６.
［１２］ 王天宇，杜瑞恒，郝 凤．夏谷高度雄性不育系的研究与利用［Ｊ］．中国农业科学，１９９３，２６（６）： ８８．
［１３］ 赵治海，崔文生，杜 贵，等．谷子光（温）敏不育系８２１选育及其不育性与光、温关系的研究［Ｊ］．中国农业科学，１９９６，２９（５），２３－３１.
［１4］ 贺浩华，刘宜柏，蔡跃辉，等．水稻显性核不育及其恢复性的遗传规律研究［Ｊ］．中国水稻科学，１９９９，１３（３）：１４３－１４６．
［１5］ ＨＵＡＮＧ Ｔ Ｙ，ＷＡＮＧ Ｙ Ｐ，ＭＡ Ｂ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｎｇｘｉａｎｇ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｅ ｒｉｃｅ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００７，３４（７）：６１６－６２２．