刘玉真，成杰民
（山东师范大学人口·资源与环境学院，济南 ２５００１４）
摘要：研究了添加改性纳米黑碳（ＭＢＣ）对棕壤中有效态Ｃｕ、呼吸强度和酶活性影响。结果表明，添加ＭＢＣ降低了棕壤ｐＨ 和有效态Ｃｕ含量，且随着ＭＢＣ施入量的增加，土壤有效态Ｃｕ含量逐渐降低；ＭＢＣ的施入，提高了土壤脲酶活性，对过氧化氢酶活性有较弱的抑制作用，对土壤呼吸作用的影响是先增强后减弱，培养后期，呼吸强度与对照无显著性差异。相关性分析表明，过氧化氢酶活性与有效态Ｃｕ含量之间有极显著正相关关系，与黑碳施入量之间有极显著负相关关系，土壤有效态Ｃｕ含量与ＭＢＣ施入量之间有极显著负相关关系，说明ＭＢＣ对棕壤中Ｃｕ有较好的钝化效果，增加了土壤脲酶活性和土壤呼吸作用，在Ｃｕ污染土壤修复中具有一定的应用前景。
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关键词 ：改性纳米黑碳；棕壤；铜；酶活性
中图分类号：Ｘ５３文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０３－０５７８－０４
黑碳（Ｂｌａｃｋ Ｃａｒｂｏｎ）是生物体或化石原料的挥发分在不完全燃烧或高温热解时转化成的产物［１，２］，是具有羧基、酚羟基、羰基等含氧功能团［３］的芳香族化合物。改性纳米黑碳（ＭＢＣ）是黑碳制备过程中采用一定的制备工艺制备的粒径达到纳米级的黑碳，由于其巨大的比表面积、高的活性点位以及优良的吸附性能，在环境污染治理领域得到了广泛的应用。Ｙａｎｇ等［４］用小麦和水稻秸秆焚烧而成的黑碳，对敌草隆的吸收效率是普通土壤的４００～５００倍；龚兵丽等［５］发现黑碳对废水中亚甲基蓝染料有较强的吸附能力；王汉卫等［６］研究表明黑碳经ＨＮＯ３氧化改性后，Ｃ＝Ｃ和Ｏ－Ｈ官能团明显增多，更利于对带正电荷物质的吸附。Ｂｏｒａｈ等［７］等研究了经Ｈ２ＳＯ４改性的黑碳对Ａｓ５＋最大吸附量可达６２．５２ ｍｇ／ｇ。众多研究［８］表明，纳米黑碳具有强的吸附能力，且其在土壤中普遍存在，目前的研究还没有发现其对种子发芽、植物生长有毒害作用。因此，纳米黑碳用在重金属污染土壤的修复中具有广阔的前景。但纳米黑碳经氧化改性后引入大量含氧官能团，降低了表面电负性［６］，若将改性纳米黑碳应用于修复重金属污染土壤，对重金属的钝化效果以及对土壤微生物活性影响尚未得知。
本研究选择酸性棕壤作为实验土壤，通过室内培养试验，研究了改性纳米黑碳对棕壤中有效态Ｃｕ及土壤呼吸强度、过氧化氢酶活性和脲酶活性的影响，为改性纳米黑碳在铜污染土壤修复应用中提供理论依据。
１材料与方法
１．１供试材料
供试土壤采自山东农业大学农场烟叶田（已收，未耕作），采样深度为０～２０ｃｍ，样品经风干后磨碎过２０目筛。混合均匀后储藏备用。土壤有机质７．６％，总Ｃｕ ３５．８ ｍｇ／ｋｇ，有效态Ｃｕ ２．８０ ｍｇ／ｋｇ，ｐＨ（１∶２．５）５．４２，土壤基本理化分析参照文献［１２］。
供试纳米黑碳（ＢＣ）购自济南泰龙橡胶有限公司，其吸碘值７００～９００ｇ／ｋｇ，氮吸附比表面积（８００～９００）×１０３ ｍ２／ｋｇ，平均粒径３０～４０ ｎｍ，灰分≤５％～８％；６５％浓硝酸，高锰酸钾为分析纯。
１．２改性纳米黑碳的制备
称取１０ｇ纳米黑碳于２５０ ｍＬ锥形瓶中，加入１２０ ｍＬ ０．２ ｍｏｌ／Ｌ酸性高锰酸钾溶液（酸度为２．６７ ｍｏｌ／Ｌ），水浴９０℃加热氧化３ｈ。然后将反应产物转移到５００ ｍＬ离心杯中，离心去除上清液，用去离子水反复清洗、离心，直到上清液的ｐＨ维持稳定，移至烘箱中，在６０～８０ ℃下烘干至恒重后置于干燥器内保存备用。
１．３培养试验
试验设６个处理：对照（ＣＫ），不加ＭＢＣ；加入 ０．１％ ＭＢＣ；加入 ０．３％ ＭＢＣ；加入 ０．５％ ＭＢＣ；加入 ０．７％ ＭＢＣ；加入１．０％ ＭＢＣ；改性纳米黑碳的加入是混施，即把改性纳米黑碳与污染土壤按照设计的比例均匀混合。每个处理 ３ 次重复。土壤培养所用容器为３００ ｍＬ 聚乙烯杯子，每个杯子装混合材料２００ ｇ。试验在（２５±１）℃的恒温培养箱内培养，每隔１ ｄ 用去离子水给土壤补充水分，使土壤水分达到田间持水量的 ７０％左右。分别在第１０、３０、６０天取样分析，试验期为２个月。
１．４分析方法
土壤中生物有效态Ｃｕ含量测定采用ＤＴＰＡ提取法［１２］，土壤ｐＨ为６．８２～７．３２，因此用ｐＨ ７．３的ＤＴＰＡ浸提剂提取，提取液离心，过滤，滤液中 Ｃｕ２＋用火焰原子吸收光谱仪测定。
土壤ｐＨ［９］采用电位法测定［9］；有机质测定方法采用重铬酸钾外加热氧化法［１０］；土壤呼吸强度的测定采用密闭静置培养法［１１］，即利用一定浓度的ＫＯＨ溶液吸收土壤呼吸作用释放出的ＣＯ２，根据ＫＯＨ溶液消耗的量计算出ＣＯ２的体积。脲酶活性以１ ｇ土壤在３７ ℃培养２４ ｈ释放出ＮＨ３－Ｎ的毫克数来表示，采用钠氏比色法测定［１２］；土壤过氧化氢酶活性以１ ｇ土壤、２０ ｍｉｎ内消耗０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＫＭｎＯ４毫升数表示，采用高锰酸钾滴定法测定［１３］。
２结果与分析
２．１ＭＢＣ对棕壤中有效态Ｃｕ含量的影响
由图１可知，与对照相比，施入不同比例ＭＢＣ处理的土壤中有效态Ｃｕ的含量均有不同程度的降低，且随着培养时间的增加，缓慢降低。培养６０ ｄ后，施入０．１％、０．３％、０．５％、０．７％和１．０％ ＭＢＣ的处理与未施入材料的对照相比，土壤有效态Ｃｕ分别降低了１３．０％、２７．８％、２９．３％、３６．１％、４７．２％。
试验结果表明，施入改性纳米黑碳降低了棕壤中有效态Ｃｕ含量，一方面纳米黑碳改性后引入了－ＣＯＯＨ、－ＯＨ等，使含氧官能团增加［１４］，可以与Ｃｕ２＋发生络合作用，从而钝化棕壤中Ｃｕ２＋，使其有效态含量降低；另一方面，以往研究表明，当ｐＨ从３到８时，ＭＢＣ的Ｚｅｔａ电位从－２０ ｍＶ降低到－６０ ｍＶ，ＭＢＣ表面所带负电荷量明显增多［１５］，与未改性纳米黑碳比，吸附带正电荷污染物（Ｃｕ２＋）的能力增强，降低了土壤中有效态Ｃｕ含量。
２．２ＭＢＣ对棕壤过氧化氢酶和脲酶活性的影响
研究表明［１４－１６］，过氧化氢酶参与土壤生物的呼吸代谢，其活性与土壤微生物数量、土壤氮、磷、钾元素的有效性等相关，且在土壤碳、氮、磷循环过程中起着重要作用，脲酶的酶促反应产物氨是植物氮源之一，其活性可以用来表示土壤供氮能力［１７］，因此，本研究通过探讨ＭＢＣ施入对土壤过氧化氢酶和脲酶的活性影响，了解ＭＢＣ在钝化重金属的同时，能否对土壤生态环境造成影响，明确ＭＢＣ在钝化修复重金属污染土壤应用中的环境风险。
由图２可知，棕壤施入ＭＢＣ后，其过氧化氢酶活性总体上降低，但不同的施入比例和不同的培养时间，降低程度不一样。在培养初期，施入比例≤０．５％时，ＭＢＣ的施入对棕壤过氧化氢酶活性影响不明显，但培养超过３０ ｄ后，对过氧化氢酶活性的影响明显增大；同样的培养时间下，ＭＢＣ施入比例越大，棕壤过氧化氢酶活性越低，尤其在培养后期，ＭＢＣ对棕壤过氧化氢酶活性的抑制作用更明显，当施入比例为０．７％和１．０％时，培养６０ ｄ，棕壤过氧化氢酶活性与对照相比，分别降低了３４．５７％、３５．０１％。由图３可知，与对照相比，施入ＭＢＣ能明显提高土壤脲酶活性。方差分析表明，在培养１０ ｄ时，施入不同比例ＭＢＣ对土壤脲酶活性的影响不明显，但培养３０ ｄ和６０ ｄ后，施入ＭＢＣ对土壤脲酶活性的影响较大；与对照相比，施入０．１％、０．３％、０．５％、０．７％和１．０％ＭＢＣ，培养６０ ｄ后，棕壤脲酶活性分别提高了８７．５４％、９０．０８％、９７．４５％、９８．３０％、９５．１８％。
由上述研究结果可知，施入ＭＢＣ能抑制棕壤过氧化氢酶活性，施入比例较低时，抑制作用较弱，施入比例增加，抑制作用增强；但施入ＭＢＣ能明显激活土壤中脲酶活性。相关性分析表明，棕壤过氧化氢酶活性与土壤有效态Ｃｕ含量有极显著正相关关系，与ＭＢＣ施入量之间有极显著负相关关系，棕壤脲酶活性与ｐＨ之间有极显著负相关关系，与土壤有效态Ｃｕ含量有显著负相关关系；可见，土壤酶活性除与土壤施入ＭＢＣ的量有关外，还与重金属含量有关。
２．３ＭＢＣ对棕壤呼吸强度的影响
由图４可知，培养１０ ｄ时，施入０．１％、０．３％和０．５％ ＭＢＣ的处理棕壤显著高于对照，培养３０ ｄ时，除施入０．１％ ＭＢＣ的处理呼吸强度显著高于对照外，其他均无显著变化。培养６０ ｄ时，除施入１．０％ＭＢＣ的处理呼吸强度与对照相比无显著性差异外，其他施入比例的处理土壤呼吸强度均显著高于对照。
在相同的培养时间下，随ＭＢＣ施入比例的增加，棕壤的呼吸强度先增加后降低；但无论培养１０ ｄ、３０ ｄ还是６０ ｄ，施入０．１％ ＭＢＣ的处理，土壤呼吸强度都是最强的，这是因为初始施入少量的ＭＢＣ，刺激了土壤微生物的呼吸，使呼吸作用增强，但随着施入量的增加，土壤的Ｃ／Ｎ增高，土壤中没有足够的氮素供微生物繁殖生长，微生物的数量和活性降低，因此呼吸强度下降［１８］。
２．４相关性分析
棕壤有效态Ｃｕ含量、酶活性、呼吸强度与ＭＢＣ施入量的相关分析（表１）表明，过氧化氢酶活性与有效态Ｃｕ之间具有极显著正相关关系（Ｐ＜０．０１），与黑碳施入量之间具有极显著负相关关系（Ｐ＜０．０１）；土壤有效态Ｃｕ含量与ＭＢＣ施入量之间具有极显著负相关关系（Ｐ＜０．０１）；而呼吸强度与黑碳施入量、脲酶活性和过氧化氢酶活性没有明显的相关关系。酶活性、有效态Ｃｕ含量与ＭＢＣ施入量间的相关性分析表明，ＭＢＣ的施入，降低了土壤有效态Ｃｕ含量，抑制了过氧化氢酶活性。有报道表明［１９］，冶炼厂附近铜污染的农田土壤中过氧化氢酶对Ｃｕ十分敏感，且高浓度Ｃｕ２＋对过氧化氢酶活性有一定的抑制作用，除此之外其活性强弱受到土壤中多种因素的影响。本试验过程中，土壤中铜浓度相对较低，可能对过氧化氢酶的抑制作用较弱，但施入ＭＢＣ后，改变了土壤有机质含量、Ｃ／Ｎ等，因此出现有效态Ｃｕ含量降低而过氧化氢酶活性减弱的结果。由表１得知，脲酶活性与有效态Ｃｕ含量显著负相关，是因为施入ＭＢＣ降低了有效态Ｃｕ含量，增加了脲酶的活性，这与许多研究结果［２０－２２］也是一致的。
３结论
ＭＢＣ降低了棕壤有效态Ｃｕ含量，且培养时间越长、施入比例越大，土壤有效态含量越低；施入ＭＢＣ抑制了棕壤过氧化氢酶活性，且施入比例较低时，抑制作用较弱，施入比例增加，抑制作用增强；但施入ＭＢＣ能明显激活土壤脲酶活性；棕壤的呼吸强度随ＭＢＣ施入比例的增加先增加后降低，与对照相比，在不同的培养时间下，影响规律不同。相关性分析表明，过氧化氢酶活性与有效态Ｃｕ之间有极显著正相关关系，与ＭＢＣ施入量之间有极显著负相关关系，相关系数分别为０．９７３和－０．９６３，其中影响过氧化氢酶活性的因素复杂；土壤有效态Ｃｕ含量与ＭＢＣ施入量之间有极显著负相关关系，相关系数为－０．９７０，再次证明了ＭＢＣ施入量越大，对棕壤中Ｃｕ的钝化效果越好。
综上所述，ＭＢＣ能显著降低棕壤有效态Ｃｕ含量，激活脲酶活性，微弱抑制过氧化氢酶活性，对土壤呼吸强度无显著影响，在重金属污染土壤修复中具有一定的应用前景，但其对其他类型土壤酶活性的影响应做进一步研究。
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