金真，王康丽，梁佳惠，梁树乐
（中国农业大学（烟台），山东烟台264670）
摘要：为获得高效的适合‘章姬’草莓茎尖培养的技术方案，试验通过不同培养基和外源激素对‘章姬’草莓茎尖培养的研究，建立其组培快繁体系，结果表明：在不同的处理中，最适宜的培养基和培养方式如下：（1）剥取的茎尖越大，萌发率越高。（2）在改良White 培养基配方+蔗糖40 g/L，pH 5.8 的培养基培养下的茎尖成活率最高(80%)。（3）综合增殖系数与增殖苗的品质等多重因素获得增殖培养适合培养基为MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L，增殖系数为3.8。（4）生根培养基以1/2 MS+蔗糖30 g/L为宜。采用各项最适的方案进行‘章姬’草莓的培养，可以达到优质高效的目的。
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关键词 ：草莓；章姬；茎尖培养
中图分类号：S668.4 文献标志码：A 论文编号：2014-0643
基金项目：中国农业大学（烟台）2014本科URP培养计划“草莓脱毒苗组培技术体系优化的研究”(U2013002)。
第一作者简介：金真，女，1993年出生，山东青岛人，本科，主要从事园艺植物组培及设施园艺工程的研究。E-mail：jz19930507@qq.com。
通讯作者：梁树乐，男，1971 年出生，副教授，博士，研究方向：植物组织培养及观赏园艺。通信地址：264670 山东省烟台市莱山区滨海中路2006 号中国农业大学烟台校区，E-mail：shuleliang@126.com。
收稿日期：2014-06-30，修回日期：2014-11-17。
0 引言
草莓是蔷薇科(Rosoideae)草莓属(Fragaria L.)多年生草本植物，果实酸甜可口，营养丰富，是经济价值较高的天然高档食品，市场需求量极大，中国已成为栽培草莓最多的国家之一[1]。草莓是靠匍匐茎进行无性繁殖的作物，经过几代繁殖之后，容易感染多种病毒而患病。患病的草莓生长缓慢、叶片皱缩、果实小而畸形、品质变差，并且病情逐年加重[2]。在国内已造成损失的草莓病毒主要有草莓斑驳病毒(SMoV)、草莓轻型黄边病毒(SMYEV)、草莓镶脉病毒(SVBV)、草莓皱缩病毒(SCrV)等4 种。草莓植株一旦感染病毒，通过常规的药剂很难进行防治，这极大地制约了草莓产业的发展。
由于国内对草莓病毒病的研究起步较晚，关于草莓病毒病方面一些研究内容仍显不足。目前草莓无病毒苗的培育方法，主要有热处理法、花药培养法和茎尖组织培养法等。其中茎尖培养不仅可以有效脱除病毒，而且可以快速繁殖、工厂化培育草莓苗，对草莓新品种的推广起重要作用[3]。近几年来这一领域的研究已经有较多报道，也建立了一些重要草莓品种的生产技术体系[4]。不过，在草莓无病毒苗工厂化生产过程中，依然存在着增殖速度慢、培养进程长等缺陷[5]。
为了取得较好的脱毒效果，在保证成活的前提下尽量切取较小的茎尖生长点，生长点太小也增加培养的难度，所以微茎尖的启动培养是茎尖脱毒培养的关键环节，文献上也多有报道，但方法不一，培养基的外源激素的种类及浓度差异较大[6-9]。此外，微环境的控制对茎尖的培育也有很大的影响，Kozai 等[10]研究表明，改变组培微环境使其更接近自然条件，有利于移栽的试管苗加速驯化。
‘章姬’草莓在国内栽培面积大，据中国园艺协会草莓分会的统计显示，2011 年‘章姬’在中国的栽培面积超过4300 hm2，位列主栽品种第7 位[11]。缩短周期从脱毒苗获取的数量而言能达到成倍的增加，因此，探究草莓脱毒技术对草莓产业的发展具有重大意义。试验以茎尖培养法为基础，通过探究不同培养基及激素组合，以期得到高效的适合‘章姬’草莓茎尖培养的技术方案。
1 材料与方法
供试材料采自中国农业大学（烟台）学校基地，选择草莓品种‘章姬’6—9 月萌发的草莓匍匐茎作为试验材料，此阶段匍匐茎要求生长充实，小叶尚未展开，剪取4~5 cm长的匍匐茎顶部。
1.1 材料的灭菌消毒
先用洗洁精洗刷草莓匍匐茎表面污物及绒毛，再用流水冲洗30 min~1 h。在超净操作台上，将冲洗后的材料留匍匐茎2~3 cm长，先后用75%酒精消毒30 s、用0.1%的升汞溶液消毒6~7 min，并分别用无菌水冲洗3~5次。
1.2 茎尖的剥离与培养
将消毒后的草莓匍匐茎用镊子夹到经过高压灭菌的盛有滤纸的培养皿中，置于双筒解剖镜下，剥离幼叶，切取不同大小的茎尖，保留1~2 个叶原基以提高茎尖的成活率。将切取后的茎尖立即置于茎尖启动培养基上，蔗糖30 g/L，经121℃压力灭菌15 min 后置于温度25℃，光照1500~2000 lx、日照时数16 h 的培养条件下进行启动培养。试验采用6 组培养基，按GA、IBA、6-BA、NAA、IAA等激素进行不同浓度的配比，维持培养基pH 5.8，并附加有蔗糖30~40 g/L，琼脂6~7.5 g/L。培养基的组成分别如下：①MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA0.2 mg/L+ GA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L；②MS+ 6-BA0.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L；③MS+ 6-BA1.0 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L；④MS+ 6-BA1.0 mg/L+ GA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L；⑤改良White 培养基+蔗糖40 g/L；⑥MS培养基+蔗糖30 g/L。
1.3 增殖与生根培养
切取无根植株转入以MS为基本培养基，增加不同生长素和细胞分裂素浓度，pH 5.8 的培养基中进行增殖培养，每20天转换1 次培养基。
取增殖后生长健壮的无根植株插入1/2 MS+蔗糖30 g/L，pH 5.8，琼脂6~7.5 g/L 的培养基中培养，2 周后上述无根植株100%生根，3周后，根系的长度均≥2 cm，达到移栽对根系的要求。
1.4 试管苗的移栽
将根系长度超过2 cm 的植株，移栽于穴盘，基质成分为德国大汉草炭土:珍珠岩=2:1，观察其炼苗移栽情况。
2 结果与分析
2.1 茎尖大小对成活率的影响
从草莓‘章姬’品种的匍匐茎上分别剥取≤0.2、0.2~0.4、≥0.4 mm 大小的茎尖，采用启动培养基MS+GA0.5 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 0.2 mg/L 进行茎尖的培养，2 周后，茎尖生长至1 mm，剥取茎尖的大小直接影响茎尖的成活率，结果如表1。茎尖越大，成活率越高，反之，茎尖越小，成活率越低。在同样的培养基中培养，茎尖≤0.2 mm的成活率仅为20%，茎尖≥0.4mm的成活率达75%，茎尖0.2~0.4 mm 成活率为62.5%。通过SSR法进行显著性检验后可以更直观地得出，茎尖≥0.4 mm的成活率显著高于茎尖0.2~0.4 mm的成活率，极显著高于茎尖≤0.2 mm 的成活率，而0.2~0.4 mm的茎尖成活率也极显著高于≤0.2 mm茎尖的成活率。从脱毒的角度来看，在保证外植体成活的前提下，茎尖的生长点应越小越好。
根据激素对植物影响的不同，将有利于茎尖启动的各种激素进行配比，探究最优的启动培养基，从表2中可以得出，以⑤改良White 培养基+蔗糖40 g/L，pH 5.8，加入琼脂6~6.5 g/L 的培养基培养下的茎尖成活率最高，达80%，经显著性检验后也可以得出应用此培养基培养的茎尖成活率极显著高于其他培养基。⑤培养基采用MS培养基中的有机物和铁源配方，其他配方均采用原White 培养基配方。⑤培养基中仅含激素IAA，且无机盐浓度相对MS培养基较低，蔗糖浓度相对较高。①MS+ GA 0.5 mg/L+ IBA 0.2 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L 培养基的茎尖成活率仅次于⑤，达65%，显著高于②培养基，极显著高于其他培养基，与培养基④以及空白对照培养基⑥相比，可以得出，适宜浓度的激素IBA对茎尖的成活有促进作用。培养基②茎尖成活率也比较高，达55%，极显著高于其他培养基，与培养基③以及空白对照培养基⑥相比可得，在茎尖启动培养时，高浓度的6-BA在一定程度上对茎尖的成活产生了一定的抑制作用。已启动的茎尖生长点呈现鲜嫩的绿色，每4周更换1次新鲜培养基，培养基配方不变，3个月后，茎尖可生长分化成直径3~5 cm的芽丛。
2.2 增殖培养
采用表3 的不同的培养基组合，观察到在相同的低浓度的NAA条件下，随着6-BA浓度的增加，增殖系数增大，但在①6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.05 mg/L 的培养下，出现玻璃化苗加重，畸形苗多，并且随着继代次数的增多，玻璃化苗有加重的趋势。当在②6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.05 mg/L 时，幼苗的玻璃化现象有所减轻，只零星出现玻璃化苗。而在③MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA0.05 mg/L 中，草莓苗生长健壮，没有玻璃化苗出现的情况，经30天左右转换1 次新鲜培养基，增殖系数能达到3.8，也可以满足生产的要求。
2.3 组培苗的生根培养
邓群仙等[12]采用不同的培养基配方进行生根诱导后，得出最适生根培养基为1/2 MS+蔗糖30 g/L 和1/2 MS+ IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L。试验对此2 种培养基做进一步的探究，2 周后调查生根情况，试验结果（表4）表明，同样作为根系诱导的高效配方，不添加激素的培养基①1/2 MS+蔗糖30 g/L 对根系的诱导反而高于添加激素的培养基②1/2MS+ IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，并且无激素苗根系生长健壮。
2.4 试管苗的移栽
当生根培养的植株根系长到2 cm时，将瓶放到温室中进行1~2 天炼苗，然后打开瓶盖，在瓶中加入少量清水，2 天后洗净根系培养基，移栽到基质成分为德国大汉草炭土+珍珠岩(2:1)中，上方盖塑料薄膜保湿，根据气候及温度情况加盖遮荫网，植株生长健壮，成活率可达90%以上。
3 结论
研究表明，剥取茎尖的大小对茎尖的成活率有明显的影响，剥取的茎尖越大，茎尖的成活率越高；培养基的激素配比对茎尖的成活也有很大的影响，在改良White 培养基、蔗糖40 g/L、pH 5.8 的培养条件下培养的茎尖，成活率高达80%，该配方对茎尖的诱导效果显著优于其他配方；试验研究表明，6-BA浓度对幼苗的增殖系数有很大的影响，在0.5~2.0 mg/L 范围内，随着浓度的升高，增值系数增大，但高浓度高增殖系数条件下的幼苗玻璃化严重，品质变劣，综合增殖系数与增殖苗的品质等多重因素获得增殖培养适合的培养基为MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L；生根培养基以1/2 MS+蔗糖30 g/L 为宜，在此条件下，根系生长健壮，利于幼苗的生长。可采用上述各项最适的方案进行‘章姬’草莓茎尖的优化培养。
4 讨论
4.1 外植体的灭菌与脱毒
在草莓茎尖培养过程中，表面消毒是组培成功的前提，严格控制75%酒精灭菌的时间，不要超过30 s，同时用0.1%升汞灭菌6~7 min，以达到最佳的灭菌效果。此灭菌方法与夏瑾等[13]的研究结果相符。这样既保证外植体的灭菌效果，也减少对材料的伤害，从而提高茎尖成活率，保证茎尖的质量。
植物病毒在植物体内主要沿着输导组织蔓延发展，由于茎尖没有导管和筛管的分化，顶端分生组织一般没有病毒，离顶端越远，病毒侵入的可能性越大。取材过小，会增加剥离和培养的难度。何欢乐等[3]试验所用的冷处理、热处理与茎尖培养相结合的脱毒方法，获得的试管苗脱毒率可达100%，但剥取的茎尖都为0.5 mm大小，且温度处理对茎尖均存在不同程度的伤害，较难控制。因而要保证茎尖免受逆境胁迫的前提下，试验中要可切取适当大小的茎尖，以取材0.2~0.4 mm为宜。
4.2 低盐环境与茎尖的成活
虽然花药和叶片作为外植体分化率也很高，董莉等[14]利用叶片作为外植体诱导率达到了90%。但草莓茎尖培养不需要形成愈伤和再分化，培养时间较短，变异率低，是一条非常有价值的组织培养快繁途径[15]。本试验以‘章姬’草莓茎尖为外植体，在初代培养基⑤的培养条件下，茎尖成活率高达80%。试验中所应用的⑤培养基较之MS基本培养基而言，无机盐浓度相对较低，其高成活率可能与低盐环境有密不可分的关系，经过试验观察，笔者认为低盐环境可能对茎尖的渗透作用影响较小，有利于茎尖的诱导成活，在这方面前人未有提及。
4.3 幼苗玻璃化的规避
试管苗玻璃化现象是植物组织培养中普遍发生的特有的一种生理性病变，草本植物更易出现玻璃化[16]。草莓属于草本植物，在组织培养的过程中也常出现玻璃化现象，前人多是通过一些影响草莓组培苗玻璃化的单因子试验来研究草莓组培苗玻璃化的问题[17-18]。增加培养基中细胞分裂素6-BA的浓度，草毒试管苗的玻璃化率有明显的提高，这与李海刚[19]对牡丹和赵佐敏[20]对非洲菊的研究相似。Kevers等[21]认为，玻璃化的发生较易受到培养基中的细胞分裂素的影响。因细胞分裂素而引起的玻璃化苗，往往具有莲节短、分枝多等特点。这可能是因为细胞分裂素促进细胞的分裂，细胞大量生长。此外，据Gaspar[24]报道，大量的乙烯产生于石竹试管苗玻璃化过程中，乙烯在玻璃苗中的产生量在各个阶段总是高于正常苗的乙烯产生量，但当乙烯以及乙烯前体ACC在组培容器中的含量提高时不会诱导玻璃苗的产生，这表明可能不是因为乙烯的大量产生而诱发组培苗玻璃化的发生。因而，玻璃化现象的出现也可能与植物体多代培养时内源激素的累积有关，内源激素的累积导致植物生长后期品质变劣，营养元素供应不上，生长势弱，抵抗力差，从而表现出玻璃化。
在增殖培养中，研究发现，随着继代次数的增加，组培苗玻璃化程度加重。当6-BA 2.0 mg/L时，增殖系数很高，但苗细、黄弱，玻璃化严重。6-BA浓度高而引起组培苗玻璃化并且褐化是草莓组培中较常出现又较难解决的问题，往往易造成组培苗死亡率过高，性状难以稳定[22]。为有效规避草莓幼苗玻璃化现象，研究表明，草莓继代增殖的适宜培养基为MS+ 6-BA0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L，这与牟彤等[23]的研究结果相符。本试验在继代培养时，通过减少细胞分裂素水平，逐步降低6-BA的浓度，或者转接到MS空白培养基中过渡，再转到含有低浓度细胞分裂素的培养基中，既保证了较高的增殖系数，又获得了健壮的种苗为后期的移栽做准备。
4.4 外源激素与生根培养
很多研究表明，添加激素有利于发根[12,15-16,24]，但是本试验研究结果表明，不添加激素的1/2MS+蔗糖30 g/L 培养基不仅能够同样满足草莓苗生根的要求，而且根系粗壮，须状根系少，有利于后期的移栽成活，同时也减少了幼苗因长期的激素富集而引起的质量下降；而添加激素的1/2 MS+ IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培养基培养的幼苗，其根系细弱、密集，从试管苗的继代与移栽成活的角度考虑是不利的。
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