丁璟剑，万中义，方 伟，彭冬麟
（湖北省生物农药工程研究中心／湖北省农业科技创新中心生物农药研究分中心，武汉 ４３００６４）
摘要：通过优化发酵培养基中的成分及其含量，提高诺沃霉素有效组分的产量。以高效液相色谱检测目标产物的峰面积作为指标，通过单因素试验获得最佳碳源及氮源。使用正交试验等获得最佳发酵培养基：葡萄糖４.0％，酵母浸粉０．５％，豆粕１.0％，磷酸氢二钾０．０３５％，碳酸钙０．０５％，豆油０．１％。相关发酵条件为ｐＨ ７．０，种龄９６ ｈ，接种量１０％，发酵温度２８ ℃，发酵时间１２０ ｈ。根据高效液相色谱检测结果，在最佳发酵条件下，目标产物产量比对照培养基提高了657％。
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关键词 ：培养基优化；正交试验；诺沃霉素；发酵条件
中图分类号：Ｑ９３９．９ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）16－3928-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.024
收稿日期：２０１５－０４－１５
基金项目：湖北省农业科技创新中心资助项目（２０１４－６２０－００８－００１）；湖北省农业科学院竞争性计划项目（２０１４ｊｚｘｊｈ０４）
作者简介：丁璟剑（１９９０－），男，湖北武汉人，学士，主要从事生物农药发酵工艺研究，（电话）１３５４５１７１７６７（电子信箱）ｄｊｊｇｏ１９９０＠１６３．ｃｏｍ；
通信作者，万中义，研究员，博士，主要从事农用抗生素研究，（电话）１３９７１０６２１７６（电子信箱）ｗａｎｚｈｏｎｇｙｉ１９６４＠１２６．ｃｏｍ。
随着化学农药的长期大量使用，各种问题逐渐暴露出来，如利用率低、难降解、污染范围广、选择性不高、害虫产生抗药性、危害人类健康等。因此，生物农药逐渐受到人们的重视［１］。相对于化学农药而言，生物农药具有选择性高、环境相容性好、对天敌较安全、不容易产生抗性、生产工艺比较简单等优点［２］。
根据来源，生物农药可分为植物源、微生物源等，农用抗生素是源于微生物的一类具有明确化学结构、明确活性的天然产物［３］。在中国农用抗生素属于生物化学农药，它具有生物农药环境相容性好的优点，也有化学农药活性明确、使用效果好的优点，因而是现在和将来最受欢迎的生物农药种类。
诺沃霉素（Ｎｏｖｏｎｅｓｔｍｙｃｉｎ）是湖北省生物农药工程研究中心在世界上首次发现的一种新的３２元大环内酯类抗生素［４］，具有广谱抗真菌活性。该抗生素对很多植物病原真菌如黄瓜棒孢菌、芒果褐斑病菌、立枯丝核菌等具有很强的活性，活性强度（最低抑菌浓度ＭＩＣ）超过多烯类抗生素、放线菌酮，具有良好的应用开发前景。提高产生菌发酵水平，对于其工业化生产是十分重要的。试验着重研究其摇瓶培养基的优化。
培养基是用来供抗生素产生菌生长、繁殖、代谢合成抗生素的，是按一定比例组成的营养物质。培养基的成分和配比合适与否，对产生菌的生长、发育、次级代谢产物的合成有很大的影响，同时还会影响到提取工艺、产品质量及成本［５］。因此根据菌种特点探索出最适合其生长、并有较高目标产物产量的培养基是发酵技术最重要的一环，同时也为将来的工业化生产做准备。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌种 植生链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈｙｔｏｈａｂｉｔａｎｓ）ＨＢＥＲＣ－２０８２１，由湖北省生物农药工程研究中心分离保存。
１．１．２ 培养基 斜面培养基：ＩＳＰ－２培养基。采用１８ ｍｍ×１８０ ｍｍ玻璃试管，每管装琼脂培养基８～１０ ｍＬ。
种子培养基（ｇ／Ｌ）：甘露醇２０；大豆蛋白胨１０；磷酸氢二钾０．３５；碳酸钙０．５；豆油１； ｐＨ ７．０。采用５００ ｍＬ带档板三角瓶，每瓶装培养基１００ ｍＬ，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。
对照发酵培养基（ｇ／Ｌ）：同种子培养基。
１．１．３ 试验仪器 大振幅摇床ＳＰＨ－３２２２（上海世平实验设备有限公司）；高速离心机ＧＬ２１Ｍ（长沙湘智离心机仪器有限公司）；Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ ２９９６二极管阵列式检测器）；自动发酵罐ＢＩＯＴＥＣＨ－２０－２００ＪＳ（上海保兴生物设备工程有限公司）；天平ＪＹ６００２电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪ＲＥ－２０００（上海亚荣生化仪器厂）。
１．２ 试验方法
１．２．１ 菌株的摇瓶发酵 在无菌条件下，从斜面取８～１０ ｍｍ的菌饼转移至种子摇瓶中，在２８ ℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ旋转式摇床上，振荡培养９６ ｈ，然后按１０％（Ｖ／Ｖ）的接种量转接至发酵培养基中，将培养基置于２８ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ大振幅摇床上，振荡培养１２０～１４４ ｈ，即完成发酵。
１．２．２ 发酵液镜检及提取 取少量发酵液测量ｐＨ并进行镜检，再向摇瓶中加入１００ ｍＬ乙酸乙酯后，于１８０ ｒ／ｍｉｎ大振幅摇床上振荡萃取１ ｈ，离心分离出酯相，旋蒸，除去溶剂，再以１ ｍＬ甲醇溶解后，进行ＨＰＬＣ分析。
１．２．３ 产物的高效液相色谱（ＨＰＬＣ）分析 采用Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８色谱柱，１５０ ｍｍ×２．１ ｍｍ（ｉ．ｄ），粒径３．５ μｍ，柱温４０ ℃，进样量为２ μＬ，流动相为去离子水和色谱纯乙腈，梯度洗脱，检测波长为２６０ ｎｍ［６］。
１．２．４ ＨＰＬＣ分析结果的处理 根据ＨＰＬＣ紫外吸收光谱结果，可由出峰时间确定产物组分，由峰面积确定对应组分产量［７］。
１．２．５ 摇瓶发酵培养基优化［８］ 碳源单因素试验：只改变原培养基中碳源，其他组分、培养条件保持不变，按照“１．２．１”方法进行摇瓶试验。
氮源单因素试验：只改变原培养基中氮源，使用最佳碳源，其他组分、培养条件保持不变，按照“１．２．１”方法进行摇瓶试验。
碳氮源最佳比例的探索：在获得最佳碳源和氮源的基础上，进行多组试验摸索碳氮用量的最佳比例。改变碳源及氮源的用量，其他组分不变、培养条件保持不变，按“１．２．１”方法进行摇瓶试验，大致确定最佳配比。
培养基的进一步改良：在获得一些优化培养基的主要参数后，同时考虑降低生产成本等方面的问题，对培养基配方进一步改良。使用正交试验法［９，１０］，最终确定ＨＢＥＲＣ－２０８２１的最佳发酵培养基配方。
２ 结果与分析
２．１ 碳源优化
进行碳源单因素试验，改变原摇瓶培养基中碳源成分，其他组分、培养条件保持不变，培养方法按照“１．２．１”，检测方法按照“１．２．３”。试验结果如表１、图１所示。
由不同碳源的ＨＰＬＣ检测结果可以看出，ＨＢＥＲＣ－２０８２１对葡萄糖和糖蜜的吸收和利用要优于其他碳源。ＨＢＥＲＣ－２０８２１对于蔗糖和甘油利用效果不佳。镜检结果也与ＨＰＬＣ检测结果相符。根据产物产量对几种碳源进行排序，依次为糖蜜、葡萄糖、甘露醇、甘露醇*、饴糖、可溶性淀粉。综合考虑培养基成本和配制培养基的方便程度考虑，确定葡萄糖为最佳碳源。
２．２ 氮源优化
改变摇瓶培养基中氮源成分，使用葡萄糖作为氮源，其他组分、培养条件保持不变，培养方法按照“１．２．１”，检测方法按照“１．２．３”。试验结果如表２、图２所示。
由不同氮源的ＨＰＬＣ检测结果可以看出，ＨＢＥＲＣ－２０８２１对酵母浸粉的吸收和利用要明显好于其他氮源。根据诺沃霉素产量，将几种氮源进行排序，由多到少依次为酵母浸粉、玉米浆、黄豆粕、豆饼、大豆蛋白胨、棉子粉、玉米粉、硫酸铵。ＨＢＥＲＣ－２０８２１对于不溶性和无机氮源的利用效果不佳。由以上试验结果确定酵母浸粉为最佳氮源。
２．３ 碳氮源最佳比例的探索
在进行碳源、氮源单因素试验确定最佳碳氮源后。进行多组试验摸索碳氮用量的最佳比例，试验培养基配方见表３。
只改变原摇瓶培养基中碳源与氮源的用量，其他组分、培养条件保持不变，培养方法按照“１．２．１”，检测方法按照“１．２．３”。试验结果如表４、图３所示。
根据ＨＰＬＣ检测结果，组别４和６中产物产量极低，推测培养基中碳源含量高于４％，氮源含量高于２％时菌株代谢将会明显受到影响。最适宜ＨＢＥＲＣ－２０８２１生长的为组别５中的配方，相对于对照组中诺沃霉素产量提高了４５．７％，即最适碳氮源比为４∶１。在摇瓶水平上，获得ＨＢＥＲＣ－２０８２１最高产量的配方为：葡萄糖４.0％，酵母浸粉１.0％，磷酸氢二钾０．０３５％，碳酸钙０．０５％，豆油０．１％。
２．４ 碳氮源正交试验
通过上面的试验已经获得了ＨＢＥＲＣ－２０８２１生长的最佳碳源、氮源及其比例，但由于酵母浸粉作为氮源成本相对较高，从降低生产成本考虑，在保证较高产量的条件下使用更为廉价的豆粕代替部分酵母浸粉作为该菌生长所需的氮源。使用正交试验法进一步改良培养基，试验因素水平设置见表５，试验结果见表６。
按照因素水平设置表，改变原摇瓶培养基中碳源与氮源的用量，其他组分、培养条件保持不变，培养方法按照“１．２．１”，检测方法按照“１．２．３”。
Ｌ９（３３）试验结果见表６，由表６可知，影响程度由Ｒ值可知：Ｂ＞Ａ＞Ｃ，即在葡萄糖、酵母浸粉、豆粕三种影响因素中，酵母浸粉影响因素最大。由表6可知，诺沃霉素A+B峰面积最大值为编号8，即产量最高的组合为Ａ３Ｂ２Ｃ１。
综合以上结果，可以得出ＨＢＥＲＣ－２０８２１最佳发酵配方为：葡萄糖４.0％，酵母浸粉０．５％，豆粕１.0％，磷酸氢二钾０．０３５％，碳酸钙０．０５％，豆油０．１％。改良过的培养基相对于原配方培养基，诺沃霉素产量提高了657％。
３ 小结与讨论
通过碳氮源单因素试验获得植生链霉菌ＨＢＥＲＣ－２０８２１最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母浸粉。通过多组试验确定碳氮源的最佳比例约为４∶１。根据前面试验获得的相关参数，优化后的发酵培养基配方为：葡萄糖４.0％，酵母浸粉０．５％，豆粕１.0％，磷酸氢二钾０．０３５％，碳酸钙０．０５％，豆油０．１％。根据ＨＰＬＣ检测结果，在最佳发酵条件下，诺沃霉素产量比对照培养基提高了657％。
本试验仅对诺沃霉素摇瓶发酵培养基的配方进行优化，其他发酵参数如ｐＨ、接种量、发酵温度、搅拌、发酵时间等也会对发酵产生重要影响。下一步的发酵工作，将在小型自动发酵罐上进行，以优化发酵工艺，并进行中试放大，将诺沃霉素向产业化方向推进。
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