谭智文，宋春艳，郑美香，崔百会，宗成文
（延边大学农学院，吉林 延吉 １３３００２）
摘要：以笃斯越橘（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）成熟果实为试材，以钼蓝比色法测定笃斯越橘果实还原型抗坏血酸（Ｒｅｄｕｃｅｄ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，ＡｓＡ）含量进行条件优化。结果表明， ３％偏磷酸－乙酸用量为１００ μＬ、５％硫酸和５％钼酸铵用量均为２００ μＬ、以去离子水补充至１ ５００ μＬ，３０ ℃干热恒温浴显色４０ ｍｉｎ，取出室温下放置１ ｈ后，在７００ ｎｍ下测定，所得数据稳定，准确性适合用于笃斯越橘果实ＡｓＡ含量的测定；测得含量为（４０．２０±６．２３） ｍｇ／１００ ｇ ＦＷ。
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关键词 ：笃斯越橘（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）；钼蓝比色法；还原型抗坏血酸；测定与优化
中图分类号：Ｏ６５６．３１ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1713-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.047
越橘属植物超过４５０种［１］，广泛分布于欧洲、北美洲、中美洲、非洲东南部中部及马达加斯加岛以及亚洲等地。笃斯越橘（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）为杜鹃花科越桔属落叶灌木［２，３］，是我国一种野生种越橘［４］。笃斯越橘果可鲜食、也可加工，能够提制天然食品色素，浆果酸甜，果汁含有ＶＣ、ＶＥ［５，６］、Ｚｎ、Ｃｕ等，具有很大的开发前景［６］。目前，关于越橘属植物在抗性生理、光合生理、花色苷功能及分子生物学方面有较多研究［７］。对于越橘果实还原型抗坏血酸（ＡｓＡ）含量的测定及相关方法鲜有报道。
抗坏血酸（ＶＣ）是人体必需的水溶性维生素，在许多新鲜水果、蔬菜中主要以还原型ＶＣ（ＡｓＡ）存在［８］。
ＡｓＡ含量的测定方法有很多，如２，６－二氯靛酚滴定法［９］、碘量法［１０］、分光光度法［１１］、紫外分光光度法［１２］、高效液相色谱法［１３］、钼蓝比色法［１４，１５］等。根据试验测定准度和精度要求，选择简便易行、价格较低的测定方法。
本研究中，笃斯越橘蓝色果实中花青素含量相对较高，不适合用２，６－二氯靛酚滴定法、碘量法进行测定。此外，由于紫外分光光度法操作相对繁琐、光电比浊法易受到亚锡离子干扰，因此两种方法较少被采用；高效液相色谱法是极好的测定方法，能够快速、准确、简便地测定果品中ＶＣ含量，但其仪器较为昂贵，很难应用于普通实验室。钼蓝比色法实质为分光光度法，通过试验条件优化，探究出能够准确、简便、快速地进行越橘中ＡｓＡ含量的测定方法，同时为相关果品测定提供借鉴。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试材料采自吉林省汪清县兰家林场，笃斯越橘成熟果实采摘后放置于冰盒内，带回实验室，－７０ ℃冰箱保存。
１．２ 试验方法
１．２．１ 试剂与仪器 主要试剂：５％的钼酸铵溶液；０．０５ ｍｏＬ／Ｌ草酸－０．０００ ２ ｍｏＬ／Ｌ ＥＤＴＡ溶液；５％硫酸溶液；３％偏磷酸－乙酸溶液；１ ｍｇ／ｍＬ标准ＶＣ溶液。ＵＶ－２６００型紫外可见分光光度计（日本岛津制作所）；干热恒温器；真空泵。
１．２．２ 试材处理 将试材从冰箱中取出，称量２０ ｇ，倒入事先盛有一定量草酸－ＥＤＴＡ溶液研钵内研磨，然后对研磨液进行真空抽滤，滤液即刻用草酸－ＥＤＴＡ溶液定容至２５０ ｍＬ，放置４ ℃冰箱备用。
１．２．３ 试验方法 参照文献［１４］方法，改进如下：反应体系总体积为１ ５００ μＬ，ＶＣ标准溶液－草酸－ＥＤＴＡ（或果汁待测液）５００ μＬ、３％偏磷酸－乙酸１００ μＬ、５％硫酸和５％钼酸铵用量均为２００ μＬ，剩余体积以去离子水补充；３０ ℃干热恒温浴显色４０ ｍｉｎ，取出室温下放置４０ ｍｉｎ，７００ ｎｍ波长条件下测定吸光度。
波长选择试验：分别取０ μＬ ＶＣ标准溶液（对照品）、５０ μＬ ＶＣ标准溶液，采用上述方法并设定紫外可见分光光度计参数，扫描速度为中速；峰值检测，阈值１、点４；在６５０～９００ ｎｍ内进行扫描；各试剂用量试验，以０ μＬ 溶液为参比，吸光度调零，用量梯度为５０ μＬ，范围是５０～２５０ μＬ；显色温度试验：温度梯度为５ ℃，范围是１５～３５ ℃；显色时间及放置时间试验：时间梯度为１０ ｍｉｎ，前者范围是１０～５０ ｍｉｎ，后者范围是０～９０ ｍｉｎ；精密度试验：取平行样品，测定１０次吸光度值；ＶＣ标准溶液曲线制备：ＶＣ标准溶液用量梯度为１０ μＬ，范围是０ ～１００ μＬ；加样回收试验：加入５０ μＬ ＶＣ标准溶液。（上述试验数据均为３次测定的均值）
２ 结果与分析
２．１ 最适测定波长的选择
在６５０～９００ ｎｍ内进行扫描（如图１），结果显示，在６９３～７０２ ｎｍ内有较大吸收值（０．６３６），教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［１４－１６］中的结果，确定试验测定波长为７００ ｎｍ。
２．２ 偏磷酸－乙酸用量的确定
由图２可以看出，在ＶＣ反应体系中，偏磷酸－乙酸最适加入量为２００ μＬ；然而，笃斯越橘反应体系中，偏磷酸－乙酸最适加入量为初始值（５０ μＬ），综合考量，最终确定偏磷酸－乙酸用量为１００ μＬ。
２．２ 硫酸用量的确定
由图３可以看出，向反应体系中，加入５％硫酸的量为２００ μＬ最适，因此，最终确定５％硫酸用量为２００ μＬ。
２．３ 钼酸铵用量的确定
由图４可以看出，在ＶＣ标准溶液反应体系中，５％钼酸铵最适加入量为１５０ μＬ；在笃斯越橘反应体系中，５％钼酸铵溶液最适加入量为２００ μＬ，综合考虑，选取加入２００ μＬ ５％钼酸铵溶液为反应体系最适量。
２．４ 显色温度的确定
由图５可以看出，反应体系最适显色温度为３０ ℃，最终，确定反应温度为３０ ℃。
２．５ 显色时间的确定
由图６可以看出，各反应体系，在显色４０ ｍｉｎ时显现最大吸光度；虽然笃斯越橘果汁待测液显色时间－吸光度曲线有一定波动，为了试验一致性，确定显色时间为４０ ｍｉｎ。
．６ 显色后放置时间的确定
由图７可知，各反应体系在显色后６０ ｍｉｎ其吸光度较稳定；因此，显色反应后放置６０ ｍｉｎ，然后测定其吸光度。
２．６ 优化试验精密度评价
按照“１．２．３”试验方法，做１０次平行测定，结果如表１所示。ＶＣ标准溶液、笃斯越橘吸光度较稳定，ＲＳＤ≤２．０％，表明优化后反应体系的精密度良好。
２．７ 标准曲线的制备与样液ＶＣ含量的测定
按“１．２．３”的试验方法，绘制标准ＶＣ加入量与吸光度的关系（如图８），标准ＶＣ含量在０．００６ ７～０．０４０ ０ ｎｇ／μｇ内线性关系较好，服从朗伯－比耳定律，所得线性方程为ｙ＝０．１２３ １ｘ－０．０２２ ５（ｎ＝６），Ｒ２＝０．９９４ ８，方程拟合较好，能够用于测定。
２．８ 加样回收试验
参照上述方法进行吸光度值测定（ｎ＝５），结果见表２，平均回收率为８０％～１２０％，ＲＳＤ≤２．０％，说明试验准确度良好。
３ 小结与讨论
采用钼蓝比色法测定果蔬中ＡｓＡ含量，选取测定波长有所差异，由于反应体系的不同，反应最大波长会有所不同。在最适波长选取上，参考已有研究（７００ ｎｍ［１４］、７００．１ ｎｍ［１６］、７０５ ｎｍ［１５］、７４６ ｎｍ［１７］、７６０ ｎｍ［１８］、８２０ ｎｍ［１９］、８３９ ｎｍ［２０］），结合图像扫描，最终选取７００ ｎｍ波长。钼蓝比色法能够较好地应用于笃斯越橘果实ＡｓＡ含量的测定；笃斯越橘成熟果实（蓝果）ＡｓＡ含量为（４０．２０±６．２３） ｍｇ/１００ ｇ ＦＷ）。
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