胡修忠，凌明湖，王定发，程 蕾，向 敏，刘晓华，夏 瑜
（武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉 ４３０２０８）
摘要：为了检测重组蛋白ＳＰＡＧ１１Ｄ的抑菌活性，提取牛睾丸组织总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增了ＳＰＡＧ１１Ｄ基因，将该基因插入ｐＥＴ－３２ａ（＋）融合表达载体，并转入ＢＬ２１（Ｄ３）进行原核表达，通过改变ＩＰＴＧ浓度和诱导时间优化表达条件，并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示，成功扩增牛ＳＰＡＧ１１Ｄ基因，产物大小为３９０ ｂｐ，其序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布序列相一致；正确构建了原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＳＰＡＧ１１Ｄ，重组蛋白最佳表达条件为ＩＰＴＧ终浓度１．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ、诱导时间为４ ｈ；表达产物的分子质量约为３３ ｋＤａ；该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛ＳＰＡＧ１１Ｄ基因的原核表达载体，并获得了具有抑菌活性的重组蛋白Ｈｉｓ－ＳＰＡＧ１１Ｄ。
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关键词 ：牛；原核表达；ＳＰＡＧ１１Ｄ基因；抑菌作用
中图分类号：Ｓ８２３文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1135-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.027
收稿日期：２０１４－１２－１６
基金项目：武汉市农业科学技术研究院创新基金项目（ＣＸ２０１２４５）
作者简介：胡修忠（１９８０－），男，山东曹县人，畜牧师，主要从事动物遗传育种与繁殖工作，（电话）０２７－８１７７６３２３（电子信箱）ｈｕ＿ｘｉｕ＿ｚｈｏｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。
精子相关抗原１１（Ｓｐｅｒｍ aｓｓｏｃｉａｔｅｄ aｎｔｉｇｅｎ １１，ＳＰＡＧ１１）是精子膜上的一种蛋白，也是β防御素的一种，由２个相互独立的β防御素基因通过通读转录连接到一起［１］，主要在哺乳动物的睾丸、附睾和雄性生殖道中表达。ＳＰＡＧ１１被认为在雄性生殖道的先天免疫、精子的成熟以及透明带的识别和精卵结合等事件中起到重要的作用［２－４］。
雄性生殖系统的病原感染严重威胁其生殖和内分泌功能，如沙眼衣原体可以引起附睾炎并阻碍附睾内精子的运动［５］。而ＳＰＡＧ １１蛋白能够抵御病原微生物对机体生殖道的侵害。对人的ＳＰＡＧ１１各蛋白亚型研究表明，其Ｎ－端都具有抗菌活性，而且人的ＳＰＡＧ１１Ｃ蛋白抗大肠杆菌活性远大于该亚型Ｎ－端的抗菌活性［６，７］。此外还发现，猕猴的ＳＰＡＧ１１蛋白也具有抗菌活性。
目前认为ＳＰＡＧ １１在精子通过附睾的过程中参与精子的成熟。Ｚｈｏｕ等［４］发现大鼠附睾头部的ＳＰＡＧ１１Ｅ蛋白结合在精子的头部，在附睾尾部的蛋白结合在精子顶体后部，这表明ＳＰＡＧ１１Ｅ蛋白在精子通过附睾时对精子起一定的修饰作用，此外ＳＰＡＧ１１Ｅ蛋白能够提高未成熟精子的运动能力。
在牛体内共发现６种ＳＰＡＧ１１蛋白亚型：ＳＰＡＧ１１Ｃ、ＳＰＡＧ１１Ｄ、ＳＰＡＧ１１Ｅ、ＳＰＡＧ１１Ｕ、ＳＰＡＧ１１Ｖ、ＳＰＡＧ１１Ｗ［８］，它们存在于睾丸、附睾、输精管上皮以及非生殖道组织中。余树民等［９］在牦牛生殖器官中也检测到了这６个亚型的表达。
１ 材料与方法
１．１ 试剂
Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｃＤＮＡ反转录试剂盒、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和 ＢａｍＨ Ｉ限制性内切酶均购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购于Ｂｉｏｌａｂｓ公司；ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ质粒快速提取试剂盒、ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ琼脂糖凝胶ＤＮＡ纯化回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；ＴＥＭＥＤ购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司；异丙基－Ｂ－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）购自Ｍｅｒｃｋ公司；氨苄青霉素（Ａｍｐ）购自Ｓｉｇｍａ公司；丙烯酰胺、过硫酸铵、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）等均为国产分析纯试剂。
１．２ 菌种和质粒
Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）购自北京全式金生物技术有限公司；ｐＥＴ－３２ａ（＋）、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌Ｏ１３９、大肠杆菌Ｏ１５７、大肠杆菌Ｋ８８、大肠杆菌Ｋ１９９和沙门氏菌为本实验室保存。
１．３ 试验动物
刚出生的小公牛。
１．４ 引物设计
根据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的牛抗精子抗体ＳＰＡＧ１１Ｄ（ＫＣ８９９３１８．１）基因的核苷酸序列设计特异引物：Ｐ１： ５′－ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＣＴＣＧＣ －３′，Ｐ２：５′－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧ－３′
１．５ ＳＰＡＧ１１Ｄ基因的克隆和测序
取小公牛睾丸和附睾组织，于液氮中保存。ＲＮＡ提取参照文献［１０］的方法提取组织的总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇ（ｄＴ）为引物反转录生成第１链ｃＤＮＡ。以Ｐ１、Ｐ２为引物扩增ＳＰＡＧ１１Ｄ基因。反应体系（２０ μＬ）如下：ｄｄＨ２Ｏ ７．４ μＬ，模板２ μＬ，Ｐ１和Ｐ２ （１０ ｐｍｏｌ／Ｌ）各０．３ μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１０ μＬ。反应条件如下：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，６０ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，３０个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ；４ ℃保存。ＰＣＲ产物于１％琼脂糖凝胶中电泳检测。
用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收ＳＰＡＧ１１Ｄ基因的ＰＣＲ产物，连接于克隆载体ＰＵＣ５７，构建 ＰＵＣ５７－ＳＰＡＧ１１Ｄ质粒并转化ＤＨ ５α感受态细胞，提取重组质粒，经双酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。
１．６ 原核表达载体的构建
用Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和ＢａｍＨ Ｉ 双酶切ＰＵＣ５７－ＳＰＡＧ１１Ｄ，再克隆到原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）的Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和ＢａｍＨ Ｉ位点之间，构建重组表达质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＳＰＡＧ１１Ｄ，转化ＤＨ５α感受态细胞，经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆。
１．７ 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化
将鉴定好的重组质粒和空载体质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）分别转化到Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞中。挑取单菌落，接种到３ ｍＬ含Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基中，３７ ℃振荡培养过夜。取活化后的菌液０．ｌ ｍＬ加入到１０ ｍＬ ＬＢ液体培养基中，３７ ℃、 ２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养２～３ ｈ，当菌液ＯＤ６００ ｎｍ为０．６～０．８时，加入ＩＰＴＧ至终浓度１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，继续振荡培养，分别取１ ｍＬ诱导０、３、４和５ ｈ的菌液，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２ ｍｉｎ，收集菌体，加入４０ μＬ灭菌ｄｄＨ２Ｏ，再加入等体积２×ＳＤＳ加样缓冲液，混匀，煮沸５～１０ ｍｉｎ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测重组蛋白的表达情况。
分别用不同的ＩＰＴＧ剂量（终浓度为１．０、１．５、２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ） 和诱导时间（３、４、５ ｈ）进行表达条件的优化。优化表达条件后，进行１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离，经考马斯亮蓝染色、数次脱色后拍照观察结果。
１．８ 抑菌活性测定
收集诱导表达的细菌，压力破碎后离心收集上清液。利用琼脂扩散法检测重组蛋白的体外抑菌活性：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌Ｏ１３９、大肠杆菌Ｏ１５７、大肠杆菌Ｋ８８、大肠杆菌Ｋ１９９和沙门氏菌于ＬＢ液体培养基中，３７ ℃摇床振荡培养１２ ｈ。调整菌液浓度为１０８ ＣＦＵ／ｍＬ；再将菌液稀释适当倍数。将稀释后的菌液均匀涂布于平板上。待琼脂表面水分干燥后，用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取上清液０．１６ ｍＬ至牛津杯中。平皿放置４ ℃冰箱扩散８ ｈ，转入３７ ℃温箱中１０～１２ ｈ后观察并测定抑菌圈的大小。
２ 结果与分析
２．１ ＳＰＡＧ１１Ｄ基因的ＰＣＲ扩增
ＳＰＡＧ１１Ｄ基因的ＰＣＲ的产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，显示大小约 ３９０ ｂｐ左右的片段，与预计的片段大小相符（图１）。
２．２ 克隆载体的构建及鉴定
将ＳＰＡＧ１１Ｄ基因的ＰＣＲ产物连接于克隆载体ＰＵＣ５７，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经双酶切鉴定后测序。双酶切结果如图２所示，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ上发表的序列相一致。
２．３ 表达载体的双酶切鉴定
经测序鉴定正确的克隆载体经Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和ＢａｍＨ Ｉ双酶切，克隆至原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）上，构建表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＳＰＡＧ１１Ｄ，转化ＤＨ５α感受态细胞，经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆（图３）。
２．４ 原核表达产物的检测及条件优化
将含有质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＳＰＡＧ１１Ｄ阳性克隆菌分别在３７ ℃条件下经ＩＰＴＧ诱导后，用１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对表达产物进行分析。诱导后在３３ｋＤａ左右处有一明显蛋白带，与预期的大小相符，而未诱导菌没有同样大小的特征带，说明目的基因成功表达（图４、图５）。诱导最佳时间为４ ｈ，诱导最佳ＩＰＴＧ浓度为１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ。
２．５ 重组蛋白抑菌活性测定
检测了表达的重组蛋白在体外对霍乱弧菌Ｏ１３９、大肠杆菌Ｋ１９９、Ｋ８８、Ｏ１５７、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌性。结果显示，重组蛋白对霍乱弧菌的生长有抑制作用（图６）。
３ 讨论
睾丸、附睾和精囊等生殖道的感染严重威胁雄性的生殖和内分泌功能［２］。泌尿生殖道微生物大多数为表皮葡萄球菌和棒状杆菌，少数为革兰阴性杆菌、大肠杆菌、支原体、衣原体等［１１］。其中大肠杆菌可引起４０％～７０％的精子活动凝聚，使精子活力下降，从而影响生育［１２］。防御素是存在于哺乳类动物体中的抗微生物肽，在天然免疫过程中起到重要的作用，而且对机体无毒副作用。ＳＰＡＧ１１蛋白是β防御素的一种，对人、猴的研究表明一些ＳＰＡＧ１１蛋白亚型对大肠杆菌、奈瑟菌、肠球菌和葡球菌具有很好的杀伤能力。本研究表达的融合蛋白对霍乱弧菌具有明显的生长抑制现象，表明牛ＳＰＡＧ１１Ｄ蛋白具有抗菌活性，与其他物种具有类似的抗菌功能。牛ＳＰＡＧ１１Ｄ蛋白可能在抵御病原菌侵害雄性生殖道方面发挥重要的作用。
ＳＰＡＧ１１在精子成熟过程中可能起到重要的作用，未成熟精子不具有运动能力，Ｚｈｏｕ等［４］发现大鼠附睾中未成熟精子与附睾上皮细胞或能表达ＳＰＡＧ１１Ｅ（Ｂｉｎ１ｂ）的小肠上皮细胞共同培养后具有了运动能力，而加入ＳＰＡＧ１１Ｅ抗体后，未成熟精子不具有运动能力；此外还发现，精子的运动能力随ＳＰＡＧ１１Ｅ表达量的降低而下降。牛的ＳＰＡＧ１１Ｄ存在于发育后期的精子细胞中，且在精子细胞的尾部［８］，与大鼠ＳＰＡＧ１１Ｅ相类似，可能与精子的运动能力相关。
鉴于牛ＳＰＡＧ１１Ｄ在抵御微生物对机体的侵害和生殖功能方面起到重要作用，本研究表达了牛ＳＰＡＧ１１Ｄ融合蛋白，且具有很强的抑菌生物活性，而在生殖方面的功能将进一步分析研究。
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（责任编辑 程碧军）