周明亮１，杨平贵１，吴登俊２，张翔宇３
（１．四川省草原科学研究院，成都 ６１１７４３；２．四川农业大学动物科技学院，四川 雅安 ６２５０１４；３．四川省畜牧科学研究院，成都 ６１００６６）
摘要：试验以凉山半细毛羊为研究对象，采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了ＩＧＦＢＰ－１基因的ＣＤＳ全序列，生物信息学方法深入分析其序列。结果表明,ＩＧＦＢＰ－１基因的ＣＤＳ序列为７９２ ｂｐ，编码２６３个氨基酸，与牛、人、鼠的ＣＤＳ同源性分别为９７％、７６％和７４％，氨基酸序列同源性分别为９７％、６９％和７１％，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＦＪ５８９６３９．１；ＩＧＦＢＰ－１基因的氨基酸分子量为２７．８ kＤ，理论等电点（ｐＩ）为５．９９；进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近，与鸡、鱼类等亲缘关系较远；ＩＧＦＢＰ－１基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域，有一个信号肽、一个跨膜区、１６个磷酸化位点、６个Ｎ－糖基化位点和８个Ｏ－糖基化位点；二级结构分析显示无规卷曲、α－螺旋和β－折叠区域分别为６１．９８％、２４．３３％、１３．６９％；三级结构分析显示存在ＩＧＦＢＰ＿Ｎ和甲状腺球蛋白－Ⅰ型功能域。为进一步研究绵羊ＩＧＦＢＰ－１基因的功能奠定基础。
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关键词 ：ＩＧＦＢＰ－１基因；克隆；绵羊
中图分类号：Ｓ８５８．２６文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０５－１１３９－０５
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０５．０２８
收稿日期：２０１４-０７-１０
基金项目：农业部公益性行业科研专项（２０１００３０６１）；四川省畜禽育种攻关项目（０１ＮＧ０２９－１８）
作者简介：周明亮（１９８３-），男，重庆合川人，博士，主要从事藏绵羊遗传资源保护与利用研究，（电话）１５９２８９９７４３６（电子信箱）
ｚｈｏｕ７６０３０２＠１６３．ｃｏｍ；通信作者，吴登俊（１９５６-），男，教授，博士生导师，主要从事动物分子遗传育种研究，（电话）０８３５－２８８５８４８
（电子信箱）ｗｄｅｎｇｊｕｎ＠ｓｉｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
胰岛素样生长因子结合蛋白１（ＩＧＦＢＰ－１）是胰岛素样生长因子结合蛋白家族（ＩＧＦＢＰｓ）的成员之一，调节胰岛素样生长因子Ⅰ和胰岛素样生长因子Ⅱ的促有丝分裂和新陈代谢作用［１］，在低氧或饥饿、营养不良、糖尿病等不利条件下，哺乳动物外周和肝脏中ＩＧＦＢＰ－１ ｍＲＮＡ水平显著增加［２］，降低ＩＧＦＢＰ－１的水平，会导致葡萄糖耐受性降低、血压升高，甚至引起肥胖［３－５］，ＩＧＦＢＰ－１能抑制依赖于ＩＧＦ－Ｉ的细胞生长和分化［６］，高表达使生物池中ＩＧＦ－Ｉ的可用量减少［７］，引起动物机体（如鼠）的出生体质量下降［８］。
Ｏｕ等［９］运用ＰＩＲＡ－ＲＦＬＰ技术检测北京油鸡的ＩＧＦＢＰ－１基因５′的单核苷酸多态性，发现该多态性与北京油鸡群体的生长有密切关系，赵秀华等［１０］采用ＳＳＣＰ技术检测京海黄鸡的ＩＧＦＢＰ－１基因外显子的单核苷酸多态性，ＳＮＰ位点对京海黄鸡生长性状具有一定的影响。有关绵羊ＩＧＦＢＰ－１基因的序列分析、单核苷酸多态性等报道较少，本研究以凉山半细毛羊为研究对象，克隆了ＩＧＦＢＰ－１基因的全ＣＤＳ序列，利用生物信息学方法分析ＣＤＳ序列及相应的氨基酸序列，为进一步研究该基因在绵羊生长发育过程中的调控以及标记的辅助选择育种奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
以四川省凉山州布拖县的凉山半细毛羊原种场７～９月龄的凉山半细毛羊母羊为试验材料，采用颈静脉放血，宰杀后１０ ｍｉｎ内收集肝脏组织，浸泡于Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ（宝生物）试剂中，置放于液氮中保存，带回实验室于－８０ ℃冰箱中保存备用。
１．２ 引物设计
参照ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ数据库中公布普通牛（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）的ＩＧＦＢＰ－１基因（ＮＭ＿１７４５５４）的ｍＲＮＡ序列，采用Ｐｒｉｍｅ ５．０软件设计引物，Ｏｌｉｇｏ ６．０进行引物评价，采用ＮＣＢＩ网站的ＢＬＡＳＴ工具检索比对以验证引物特异性，ＩＧＦＢＰ－１引物序列为Ｆ：５′－ＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＴＣＣＴ－３′，Ｒ：５′－ＧＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴ
ＣＡＧＴＴＣＴＧＴＡＡＧ－３′，引物由大连宝生物公司合成。
１．３ 总ＲＮＡ的提取
取凉山半细毛羊肝脏组织约１００ ｍｇ，迅速放入预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至组织被研磨成粉末状，提取总ＲＮＡ，１％的琼脂糖凝胶电泳验证ＲＮＡ的完整性，核酸蛋白检测仪检测ＲＮＡ提取的浓度与纯度，提取的ＲＮＡ置于－８０ ℃保存备用。
１．４ ＲＴ－ＰＣＲ扩增
反转录反应按ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ反转录试剂盒（ＴａＫａＲａ公司）进行，反转录反应条件：３７ ℃，１５ ｍｉｎ，８５ ℃，５ ｓ终止反应。以合成的第一条ｃＤＮＡ链为模板，以ＩＧＦＢＰ－１基因的特异性引物进行ＰＣＲ扩增，扩增体系为５０ μＬ，扩增条件为９５ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性４５ ｓ，６２ ℃复性３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，１６ ℃保存。
１．５ ＲＴ－ＰＣＲ产物克隆
将回收的ＲＴ－ＰＣＲ产物与ＰＭＤ １８－Ｔ载体连接，根据凝胶电泳或核酸蛋白仪检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。轻轻蜗旋离心管以混合内容物，短暂离心，将混合反应液置于１６ ℃水浴中过夜连接。用灭菌牙签挑取单个白色菌落，接种于含有氨苄的１．５ ｍＬ ＬＢ培养液中，３７ ℃，２００ ｒ/min振荡培养过夜。次日，吸取１ μＬ菌液作模板，依据ＲＴ－ＰＣＲ扩增的体系和条件进行ＰＣＲ鉴定，通过１％琼脂糖凝胶电泳来检测目的条带。据菌液ＰＣＲ检测结果，吸取含有目的条带的１ ｍＬ菌液，送往Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。
１．６ 生物信息学分析
将测序结果与测序峰图结合进行校对，寻找基因的起始密码子与终止密码子，确定基因的编码区序列。用ＮＣＢＩ的Ｂｌａｓｔ服务器和Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ软件进行序列的同源性分析。核酸序列与其他物种比对后，利用Ｅｘｐａｓｙ服务器（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）相关软件预测各个基因的氨基酸序列的分子量、等电点和氨基酸组成等，将序列提交到ＥｘＰＡＳｙ ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ、ＨＮＮ、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ服务器，预测蛋白质的磷酸化位点、Ｎ－磷酸化位点、Ｏ－磷酸化位点、跨膜区、信号肽、疏水性、二级结构和功能域等。
２ 结果与分析
２．１ 总ＲＮＡ提取及ＲＴ－ＰＣＲ扩增
凉山半细毛羊肝脏组织中提取到的总ＲＮＡ，经１％琼脂糖电泳后可以清晰地观察到３条带，如图１所示，以迁移率从大到小依次是５S ｒＲＮＡ、１８S ｒＲＮＡ、２８S ｒＲＮＡ，２８ｓ条带亮度大约为１８S条带的２倍，５S条带亮度较低，总ＲＮＡ样品完整、降解较少、质量良好。以凉山半细毛羊的肝脏组织的ｃＤＮＡ为模板，用ＩＧＦＢＰ－１基因的引物扩增，得到的长度约８００ ｂｐ，凝胶电泳检测结果如图２所示。
２．２ 序列分析
根据正反测序进行校正，采用ＤＮＡＭＡＮ去除载体序列和寻找上下游引物序列，确定各个基因编码氨基酸的ＣＤＳ区域，ＩＧＦＢＰ－１基因的完整ＣＤＳ序列长度为７９２ ｂｐ，共编码２６３个氨基酸。利用ＮＣＢＩ中的Ｂｌａｓｔ程序比对克隆的绵羊ＩＧＦＢＰ－１基因与近源物种的同源性。同源性分析表明，ＩＧＦＢＰ－１基因与牛、人、鼠的ＣＤＳ区的同源性分别为９７％、７６％和７４％，氨基酸序列同源性分别为９７％、６９％和７１％；同源性比对结果显示克隆的基因即为绵羊的ＩＧＦＢＰ－１，基因将ＰＣＲ扩增得到的序列提交到ＮＣＢＩ数据库中，登录号为ＦＪ５８９６３９．１。利用ＢｉｏＥｄｉｔ软件对此次试验克隆得到的ＩＧＦＢＰ－１基因的ＣＤＳ编码区的碱基组成成分分析，ＩＧＦＢＰ－１基因的Ａ、Ｃ、Ｇ和Ｔ等４种碱基组成含量分别为２０．９６％、３０．８１％、２９．４２％和１８．８１％，单链分子量为２４１．９ ｋＤ，双链分子量为４８２．９ ＫＤ；ＩＧＦＢＰ－１的氨基酸分子量为２７．８ ｋＤ，理论等电点为５．９９。
２．３ ＩＧＦＢＰ－１基因的分子进化
从ＮＣＢＩ中ＧｅｎＢａｎｋ数据库下载山羊、猪、牛、鼠、人、鸡和鱼类等物种的ＩＧＦＢＰ－１基因的氨基酸序列，用Ｍｅｇａ ６．０６软件以Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ程序构建ＩＧＦＢＰ－１基因的分子系统发育树，如图３所示。ＩＧＦＢＰ－１基因与其他物种的进化关系跟传统的分类比较一致，绵羊与山羊关系最近，最先聚合，随着亲缘关系的远近逐步与牛、猪、人和鼠等哺乳动物聚为一支，再与鸡聚合，最后与来源于水生鱼类的一支聚合。
２．４ 蛋白质特性预测
２．４．１ 疏水性分析 蛋白质的疏水性分析采用ＥｘＰＡＳｙ在线平台的ＰｒｏｔＳｃａｌｅ程序计算绵羊ＩＧＦＢＰ－１的疏水性图谱，如图４所示。ＩＧＦＢＰ－１的Ｎ段区域，存在明显的疏水性区域，而在Ｎ段及中部区域存在明显的亲水性区域。因此，预测ＩＧＦＢＰ－１的中部区域是与ＩＧＦ－Ⅰ和ＩＧＦ－Ⅱ基因的结合部位，依据ＩＧＦＢＰ－１Ｎ段的明显疏水性区域，在该位置可能存在信号肽。
２．４．２ 信号肽分析 根据蛋白质的疏水性分析，ＩＧＦＢＰ－１可能存在信号肽，将ＩＧＦＢＰ－１的氨基酸序列提交到ＳｉｇｎａｌＰ ３．０服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）。如图５所示，结果表明，ＩＧＦＢＰ－１蛋白质的Ｎ段存在信号肽的概率为０．９８５，信号肽的长度为２５个氨基酸残基，切割位置为Ｇｌｙ－Ａｌａ之间。
２．４．３ 跨膜区分析 联网到“ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ－ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ”进行蛋白质的跨膜区预测，如图６所示。分析表明，ＩＧＦＢＰ－１存在两个跨膜区，分别位于９～２７和５７～７８位置处，９～２７这个跨膜区刚好位于信号肽位置，因而该基因仅存在５７～７８位置处的一个跨膜区。
２．４．４ 磷酸化和糖基化位点 利用ＮｅｔＰｈｏｓ ２．０在线磷酸化位点预测服务器，对克隆的ＩＧＦＢＰ－１的磷酸化位点预测（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／）如图７所示。ＩＧＦＢＰ－１基因中共发现１６个磷酸化位点，分别为Ｓｅｒ（１１）、Ｔｈｒ（４）和Ｔｙｒ（２）。
利用ＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０及ＮｅｔＯＧｌｙｃ３．１服务器，对克隆的ＩＧＦＢＰ－１的分子进行Ｎ－和Ｏ－糖基化位点预测（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／）。由图7可知，ＩＧＦＢＰ－１氨基酸序列中共６个Ｎ－糖基化位点，分别位于１４１、１５７、１６１、２０９、２１１、２６０等位置；Ｏ－糖基化位点的预测如图３．１１，ＩＧＦＢＰ－１氨基酸序列中共８个Ｏ－糖基化位点，分别位于１００、１０８、１０９、１１５、１１７、１２０、１２１、１２２等位置。
２．５ 二级结构分析
利用ＨＮＮ在线二级结构预测服务器对ＩＧＦＢＰ－１二级结构预测（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ），如图7所示。ＩＧＦＢＰ－１以无规卷曲为主，其次为α－螺旋，β－折叠最少。ＩＧＦＢＰ－１的无规卷曲、α－螺旋、β－折叠区域分别占６１．９８％、２４．３３％、１３．６９％。
２．６ 蛋白质功能域预测及分析
将序列递交到ＥｘＰＡＳｙ ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／）结构域分析数据库，进行蛋白质结构域的查找与分析，如图8所示。克隆的ＩＧＦＢＰ－１的Ｎ端具有一个ＩＧＦＢＰ＿Ｎ功能域序列，位于２８－１０９；在Ｃ端，具有一个甲状腺球蛋白－Ⅰ型域，位置为１７７－２５５，在该域中，具有３个二硫键，位置为１８０－２１０、２２１－２３２、２３４－２５５，同时还具有大量的Ｎ－豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化位点和蛋白激酶Ｃ等磷酸化位点；在ＩＧＦＢＰ－１（１９７－２０３，Ｋａｇ．Ｄｋｌ．Ｙ）中具有酪氨酸激酶磷酸化活化位点、一个细胞粘附序列（２５０－２５２，ＲＧＤ）和一个酰胺化位点（２３９－２４２，ｓＧＫＲ）。
３ 小结与讨论
细胞的生长、繁殖和存活依赖于细胞间的动态分子调节过程，在这种复杂的生命活动过程中，蛋白质分子扮演着重要的中介角色，在蛋白质与蛋白质、代谢物、磷脂、碳水化合物及核酸之间发挥极其活跃的作用。人类基因组直接得到的初始蛋白质结构并不能充分地解释蛋白质所表现的多种功能及其相互调节机制，几乎所有的蛋白质都要经过各种形式的修饰［１１］，在线预测显示ＩＧＦＢＰ－１存在大量的磷酸化和糖基化等修饰过程，ＩＧＦＢＰ－１是羊水中ＩＧＦ－Ⅰ的主要结合蛋白，生理作用依赖于不同的磷酸化［１２，１３］，ＩＧＦＢＰ－１的磷酸化提高了与ＩＧＦ－Ⅰ的亲和力，调节ＩＧＦ－Ⅰ的活性，特别是ＩＧＦ－Ⅰ关于胎儿与胎盘的生长［１４］。人的Ｓｅｒ１０１是一个独特的磷酸化位点，与ＩＧＦ－Ⅰ的结合极为重要，Ｓｅｒ１９的磷酸化也能提高与ＩＧＦ－Ⅰ的结合，而在Ｓｅｒ１６９和Ｓｅｒ９８的磷酸化位点并不与ＩＧＦ－Ⅰ的结合表现为相关性，ＩＧＦＢＰ－１的Ｓｅｒ９８、Ｓｅｒ１０１、Ｓｅｒ１１９和Ｓｅｒ１６９等磷酸化位点是胎儿适应性应答于低氧和营养限制的一种新机制［１５］。
蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共价结合的过程，蛋白质糖基化可以按照氨基酸和糖的连接方式分为四类：Ｏ－糖基化、Ｎ－糖基化、Ｃ－甘露糖化以及ＧＰＩ锚定连接［１６］。Ｏ－糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上，糖基化位点处的蛋白多为β构型，Ｏ－多聚糖以逐步加接单糖的形式形成低聚糖。Ｎ位糖基化是在内质网上由糖基转移酶催化，在内分泌蛋白和膜结合蛋白的天冬酰氨残基的氨基上结合寡糖的过程，一般认为Ｎ－糖基化发生在蛋白Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ序列上［１７］，少数情况下Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｃｙｓ序列也作为糖基化位点［１６］。ＩＧＦＢＰ－１的氨基酸序列中存在６个Ｎ－糖基化位点和８个Ｏ－糖基化位点。
ＩＧＦＢＰ－１在保守的Ｎ－端区域存在１２个Ｃｙｓ，形成６个二硫键，其二硫键是以相邻的２个Ｃｙｓ依次而构成，形成ＩＧＦＢＰ－１的第一亚域，在Ｃ－端的保守区域内存在６个Ｃｙｓ，以相邻两个Ｃｙｓ依次而构成３个二硫键，构成第二亚域，在绵羊的ＩＧＦＢＰ－１基因的氨基酸序列的二硫键跟人的研究一致［１８，１９］，经二硫键折叠形成稳定精细的ＩＧＦＢＰ－１的球状结构，保证了与ＩＧＦｓ结合的亲和力。在ＩＧＦＢＰ－１Ｎ－端具有一个完整ＩＧＦＢＰ＿Ｎ功能域和在Ｃ－端具有一个甲状腺球蛋白－１，从而表现出ＩＧＦＢＰ－１与ＩＧＦ－Ｉ结合的功能以及自身的独特功能。
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［１７］ ＧＡＶＥＬ Ｙ， ＶＯＮ ＨＥＩＪＮＥ Ｇ． Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｖｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｎｏｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ａｓｎ－Ｘａａ－（Ｔｈｒ／Ｓｅｒ） ｓｅｑｕｏｎｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ Ｃ ｔｅｒｍｉｎｕｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ， １９９０， ３： ４３３－４４２．
［１８］ ＮＥＵＭＡＮＮ Ｇ， ＢＡＣＨ Ｌ． Ｔｈｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－６ （ｈＩＧＦＢＰ－６） ａｎｄ ｈＩＧＦＢＰ－１ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９９，２７４： １４５８７－１４５９４．
［１９］ ＨＡＳＨＩＭＯＴＯ Ｒ， ＦＵＪＩＷＡＲＡ Ｈ， ＨＩＧＡＳＨＩＨＡＳＨＩ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｎａｒｙ ａｎｄ ｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ＩＩ （ＩＧＦ－ＩＩ）， ＩＧＦ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－３， ａｎｄ ａｃｉｄ－ｌａｂｉｌｅ ｓｕｂｕｎｉｔ［Ｊ］． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９７， ２７２： ２７９３６－２７９４２．
（责任编辑 程碧军）