摘要：[目的]克隆河八王[Narengaporphyrocoma（Hance）Bor]分蘖基因NpD53，并分析其序列特征，为甘蔗野生种分蘖的分子机理研究提供理论参考。[方法]以河八王为试验材料，提取其叶片总RNA，反转录获得cDNA，通过RACE（cDNA末端快增）技术扩增NpD53基因，并采用生物信息学方法对其核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行分析。[结果]NpD53基因（GenBank登录号MF593461）的中间序列长度760bp、5’端序列长度1497bp、3’端序列长度1233bp，拼接后其cDNA序列全长为2597bp，包含1个2037bp的开放阅读框（ORF），编码678个氨基酸，蛋白分子量75.02kD，等电点6.59，亲水性平均数-0.506，表明其为亲水性蛋白，位于细胞核内（可信度94.1%）。NpD53基因编码蛋白（NpD53）存在P-looRNTPase和ClpBD2-small超家族核心序列，含有4个非特异性位点，与其他物种的D53蛋白均具有相同的保守结构域ClpBD2-small；其二级结构仅有4种卷曲类型，以无规则卷曲最多，占42.77%，其次是α-螺旋，占35.55%，延伸链和β-转角分别占15.34%和6.34%。NpD53蛋白的氨基酸序列同源性比对及系统进化树分析结果显示，河八王与禾本科物种（高粱和山羊草）的亲缘关系较近，与海枣、油棕、芭蕉等物种的亲缘关系较远。[结论]河八王分蘖基因NpD53编码蛋白与其他物种的D53蛋白具有相同的保守结构域，且具有2个I类clDATP酶的非特异性位点，推测NpD53为一种分子伴侣，与河八王自身的耐热性相关。
关键词：河八王；NpD53基因；克隆；序列分析；RACE
0引言
[研究意义]河八王[Narengaporphyrocoma（Hance）Bor]是一个甘蔗野生种，具有分蘖力强、耐贫瘠、耐旱等优良性状（李杨瑞，2010）。甘蔗产量受单位面积有效茎数影响，而有效茎数由甘蔗的有效分蘖决定（李杨瑞，2010）。可见，分蘖是农作物茎数和穗数的重要性状因子，对作物产量有重要影响（吕爱丽等，2016），而DWARF53（D53）基因编码的D53蛋白与独脚金内酯信号分子D14蛋白和D3蛋白互作形成D53-D14-SCFm蛋白复合体，D53蛋白作为独脚金内酯信号途径的抑制子，参与植物分蘖（分枝）等生长发育过程（Zhouetal.，2013）。因此，研究河八王分蘖基因D53及其分子调控机理，利用转基因或杂交等技术进行甘蔗遗传改良对提高甘蔗产量具有重要意义。[前人研究进展]独脚金内酯是一种新型植物激素，属萜类内酯，可抑制植物分枝生长、促进侧根形成和诱导根毛伸长，从而调节植物的生长发育（Gomez-Roldanetal.，2008；吴转娣等，2017），D14蛋白、F-box蛋白和D53蛋白等参与其信号转导（陈虞超等，2015）。已有研究发现，水稻的3种DWARF蛋白（D27、D17和D10）将反式B-胡萝卜素转变成独脚金内酯的前体己内酯（Alderetal.，2012），其他2种DWARF蛋白（D14和D3）在独脚金内酯的感知和转导中起重要作用（Ishikawetal.，2005；Ariteetal.，2009）。其中D14蛋白属于α/β-水解酶折叠家族，是独脚金内酯的受体（Aldereta1.，2012），D3蛋白是一个富集亮氨酸重复序列的F-box蛋白，参与独脚金内酯信号的接收（Zhaoetal.，2013）。D53蛋白是连接独脚金内酯信号接收和应答的重要抑制因子，当D53被降解，独脚金内酯抑制植物分蘖（分枝）；当D53未被降解，则独脚金内酯受到抑制，促使植物多分蘖（分枝）（Jiangetal.，2013）。D53基因是水稻的显性基因之一。Wei等（2006）构建了水稻显性矮秆突变体dwarf（d53），通过图谱定位发现D53基因定位于11号染色体的断臂上。Jiang等（2013）克隆获得水稻的D53基因全长。[本研究切入点]目前，未见有关甘蔗野生种河八王分蘖基因的研究报道。[拟解决的关键问题]利用RACE（cDNA末端快增）技术克隆河八王D53基因（NpD53）全长，并进行生物信息学分析，为甘蔗野生种分蘖的分子调控机理研究提供理论参考。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料为河八王，保育于广西农业科学院甘蔗研究所。RNAprepPure植物总RNA提取试剂盒、DNaseIRecombinant和SMARTerRACE5'/3’Kit购白天根生化科技（北京）有限公司。其余试剂均为国产分析纯。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2总RNA提取及cDNA合成
剪取约0.1g河八王幼嫩叶片，参照RNAprepPure植物总RNA提取试剂盒说明提取其总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，并参照SMARTerRACE5’/3’Kit说明反转录合成cDNA。
1.3NpD53基因克隆
1.3.1中间序列扩增参考水稻分蘖基因D53（GeneBank登錄号KF709434.1）设计其中问序列的扩增引物（表1），反应体系（25.0uL）配置和扩增程序设置均参照2xESTaqMasterMix产品说明进行。PCR产物经胶回收纯化后连接至pMD19-T克隆载体上，转化DH5a感受态细胞，经菌液PCR验证后，把含目的片段的阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
1.3.2两端序列扩增以NpD53基因的中间序列为基础，设计NpD53基因5’与3’端RACE特异性引物（表1），采用RACE技术克隆NpD53基因的5’与3’末端序列。PCR产物经胶回收纯化后连接至pMD19-T克隆载体上，转化DH5a感受态细胞，经菌液PCR验证后，把含目的片段的阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。对测序正确的5’与3’端序列进行拼接，得到NpD53基因cDNA全长序列。
1.4生物信息学分析
利用ORFFinder找出NpD53基因的开放阅读框（ORF）編码区。将获得的NpD53基因cDNA提交至NCBI数据库中进行比对，利用BLASTI具对其编码蛋白（NpD53）进行氨基酸序列比对；基于NpD53蛋白的氨基酸序列与相似性较高的序列，利用MEGA6.0邻接法构建系统进化树，分析河八王与其他物种之间的亲缘关系。
利用ExPASyProteomicsServer在线软件ProtParam预测NpD53蛋白的理化性质；利用ProtScale预测NOD53蛋白的亲/疏水性；利用NCBIBLAST-E具预测NpD53蛋白的结构域；利用SOPMA软件预测NOD53蛋白的二级结构；利用TMHMMServerv.2.0预测NpD53蛋白的跨膜结构；利用在线软件SWISSMODEL构建NpD53蛋白的三维结构模型；利用Wolf-Sport在线软件预测NpD53蛋白的亚细胞定位。
2结果与分析
2.1NpD53基因克隆结果
由图1可知，总RNA的28S和18S条带明亮、清晰、完整，无其他杂质污染，说明提取的河八王幼嫩叶片总RNA质量较好，可用于后续试验。
PCR扩增NpD53基因，其测序结果显示，NpD53基因的中间序列长度760bp，5’端序列长度1497bp，3’端序列长度1233bp，经ContigExpress软件拼接后，其cDNA序列全长为2597bp。
2.2NpD53基因同源性比对及系统进化树分析
将克隆获得的NpD53基因cDNA序列提交至NCBI数据库中进行核苷酸序列比对，结果显示，该序列与高粱（Sorghumbicolor）（XIVl002441614.2）、玉米（ZeamarsL_）（KUl31574.1）和水稻（Orvzasativa）（KF709434.1）的D53基因核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和77%，说明本研究克隆获得的基因为河八王分蘖基因D53。利用ORFFinder找到NpD53基因的ORF编码区（238-2364bp），长度为2037bp，编码678个氨基酸，其中5’非编码区长度为237bp，3’非编码区长度为233bp（图2）。
NpD53基因编码蛋白（NOD53）与高粱（XP002441659.1）、山羊草（Aegilopstauschii）（XP02016-8048.1）、小麦（Triticumaestivum）（ARB18226.1）和海枣（Phoenixdactylifera）（XP008805019.1）D53蛋白的氨基酸序列同源性分别为91%、63%、59%和39%。利用MEGA6.0进行氨基酸多序列比对，结果（图3）显示，NpD53与禾本科物种具有较高的同源性，其中与高粱的2个D53蛋白同源性最高，分别为91%和85%，而与海枣、油棕（Elaeisguineensis）、芭蕉（Musaacuminatasubsp.malaccensis）等物种的同源性仅30%-40%，说明河八王与海枣、油棕、芭蕉等物种的亲缘关系较远，而与高粱的亲缘关系较近。
2.3NOD53蛋白的理化性质及亲/疏水性预测结果
NpD53蛋白的理化性质及亲/疏水性预测结果显示，该蛋白分子式为C3226H5162N96401034532，分子量为75.02kD，由678个氨基酸组成，其中包含负电荷氨基酸残基86个和正电荷氨基酸残基82个，丝氨酸含量最高，达13.0%；理论等电点（pI）为6.59，为酸性蛋白质；亲水性平均数为-0.506，有较多区段位于0分以下，以亲水性为主（图4），表明其为亲水性蛋白；不稳定系数为54.83，半衰期约为30h，说明其为不稳定蛋白。
2.4NOD53蛋白的功能结构域预测结果
利用NCBIBLAST-E具预测NOD53蛋白的结构域，结果（图5）显示，该蛋白存在P-loopNTPase和ClpBD2-small超家族核心序列，含有4个非特异性位点：ClpA、AAA2、ⅥClpVl和ClDC。与图3中的其他物种均具有相同的保守结构域ClpBD2-small。
2.5NOD53蛋白的二级结构和三维结构分析
NpD53蛋白的二级结构预测结果（表2）显示，该蛋白的二级结构仅有4种卷曲类型，其中无规则卷曲最多，占42.77%，其次是α-螺旋，占35.55%，延伸链和β-转角分别占15.34%和6.34%。NpD53蛋白跨膜结构预测结果显示，该蛋白无跨膜结构域。NpD53蛋白三维结构如图6所示，同源模型为MecA-ClpC复合物（3j3u.1），但同源性较低，仅19.3%。NpD53蛋白的亚细胞定位预测结果显示，该蛋白位于细胞核内，可信度94.1%。
3讨论
独脚金内酯属类胡萝卜素植物激素，Jiang等（2013）、Zhou等（2013）研究发现，在水稻中D53蛋白为独脚金内酯信号转导途径的抑制因子，Liu等（2017）发现D53基因在小麦分蘖和穗数上起一定的调控作用。本研究首次从河八王中克隆得到NpD53基因，可为后续河八王分蘖机制研究打下理论基础。
应用RACE技术可对mRNA末端进行快速扩增，具有快速、稳定和成功率高等优点，是有效获取cDNA全长的有效手段之一（唐克轩等，2002）。本研究采用RACE技术克隆获得河八王NpD53基因，其具有完整的ORF，其编码蛋白NpD53的氨基酸序列与其他物种的D53蛋白具有相同的保守结构域clpBD2-small，与禾本科物种的同源性较高，其中与高梁的2个D53蛋白同源性最高，分别为91%和85%，而与海枣、油棕、芭蕉等物种的相似性仅30%-40%，说明不同物种问的D53蛋白可能有不同的结构和功能。ClpB是HSP100/Clp蛋白家族的一员，与细胞的耐热性紧密相关，可溶解热胁迫下的蛋白聚集体，从而减少热激对细胞产生的损害，其序列具有高度保守特性（Katiyar-Agarwaletal.，2003）。其中胞质型HSPl01/ClpB蛋白是植物抗高温必需的因子，推测HSPl01/ClpB转基因水稻有较高的耐热性（Katiyar-Agarwaletal.，2003；杨金莹等，2006）。由此推测河八王中的ClpB也与植株的自身耐热性有关。
已有研究证实，D53蛋白与I类ClpATP酶类有相似的结构（Zhouetal.，2013），ClpATP酶是细菌中高度保守的调节亚基，是一种分子伴侣，其自身无水解活性，其中I类ClpATP酶类带有2个不同的ATP结合区域（Freesetal.，2007）。本研究河八王NpD53蛋白序列中的非特异性位点ClpA和ClpC属于I类，由此推测NpD53蛋白为一种分子伴侣，与河八王的自身耐热性相关。
4结论
从河八王中克隆获得的分蘖基因NpD53，其编码蛋白NpD53与其他物种的D53蛋白具有相同的保守结构域，并具有2个I类ClpATP酶的非特异性位点，由此推测NpD53蛋白为一种分子伴侣，与河八王自身的耐热性相关。
作者：刘昔辉等