摘 要：目的:分析RANKL、RANK蛋白在胶质母细胞瘤组织中的表达及临床意义。方法:收集2017年10月至2019年10月于我科行手术治疗的21例胶质母细胞瘤患者的临床资料,用蛋白印迹试验检测肿瘤中心组织、瘤周组织、皮层造瘘脑组织中RANKL、RANK表达情况,并对其进行统计学分析。结果:肿瘤中心组织RANKL表达高于瘤周组织,有统计学差异(P=0.032);瘤周组织高于皮层造瘘脑组织,有统计学差异(P=0.024)。瘤周组织RANK表达明显高于肿瘤中心组织,有统计学差异(P=0.006);肿瘤中心组织高于皮层造瘘脑组织,有统计学差异(P=0.028)。结论:肿瘤中心组织中RANKL表达高于瘤周组织、脑组织,而瘤周组织中RANK明显高于肿瘤中心组织、肿瘤中心组织高于脑组织,我们认为RANKL/RANK通路可能在胶质母细胞瘤侵袭过程中起重要作用,有待后续进一步试验。
关键词：胶质母细胞瘤 RANKL RANK 侵袭
The expression and significance of RANKL and RANK protein in glioblastoma
WANG Guowen ZHANG Minli WANG Bo SHAO Bingshui GAO Kun HE Yanyang ZHAO Hongyu
People's Hospital of Zhengzhou; Shengjing Hospital of China Medical University;
Abstract：
Objective:Analyze the expression and clinical significance of RANKL and RANK protein in glioblastoma.Methods:The clinical data of 21 patients with glioblastoma from October 2017 to October 2019 were collected.The expression of RANKL and RANK in tumor central tissue,peri-tumor tissue and cortical fistula tissue was detected and analysed with Western blotting test.Results:The expression of RANKL in tumor central tissue was higherthan that in peripheral tissue,which in peripheral tissue higher than in cortical ostomy tissue. While the expression of RANK in peripheral tissue was significantly higher than that in tumor central tissue,which in tumor central tissue higher than in cortical ostomy tissue.Conclusion:The expression of RANKL in the central tissue of glioblastoma is higher than that in the peritumor tissues and cortical fistula tissues,while the expression of RANK in the peri-tumor tissues is significantly higher than that in the tumor central tissues,and the tumor center tissue is higher than that in the cortical fistula tissues. We believe that RANKL/RANK pathway may play an important role in the invasion of glioblastoma,and we look forward to follow-up studies.
Keyword：
glioblastoma; RANKL; RANK; invasion;
胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是成人最常见、最具侵袭性的恶性肿瘤[1],约占原发恶性脑肿瘤的45%,中位生存期12～15个月[2],其手术切除难度大、易复发、预后差[3]。胶质母细胞瘤都呈侵袭性生长,主要表现为:肿瘤细胞直接浸润邻近脑组织、沿脑白质纤维束侵袭、通过脑脊液播散和沿软脑膜、室管膜下基膜及血管分布[4]。近年来,RANKL/RANK通路成为肿瘤细胞侵袭机制研究的热点,尤其是恶性肿瘤细胞侵袭过程。本文拟研究RANKL/RANK通路相关因子在胶质母细胞瘤中心组织(tumor center tissue,TCT)、瘤周组织(tumor peripheral tissue,TPT)以及皮层造瘘脑组织(cortical ostomy tissue,COT)之间的表达情况以及差异,探讨其在胶质母细胞瘤侵袭过程中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
入选标准:(1)首次发病并行手术患者;(2)术后病理显示胶质母细胞瘤,由病理科两位主治以上医师确诊;(3)标本采集遵循患者及家属知情同意原则并且获得相关医院伦理委员会批准,收取标本包括肿瘤中心组织、瘤周组织(肿瘤与水肿变性脑组织交界0.5 cm内肿瘤组织)、皮质造瘘少量脑组织。排除标准:(1)复发的胶质母细胞瘤患者;(2)其他心肺疾病等合并症患者。
收集2017年10月至2019年10月于我科行手术治疗的21例胶质母细胞瘤患者的临床资料,男9例、女12例,年龄32～71岁,平均年龄49岁。
1.2 试剂
兔抗人单克隆RANK抗体(Abcam公司)、兔抗人单克隆RANKL抗体(Abcam公司)、小鼠抗人β-actin抗体(proteintech公司)。
1.3 蛋白印迹试验
取液氮中冻存肿瘤中心组织、瘤周组织、皮层造瘘脑组织,剪刀剪碎后加入细胞核与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天)提取细胞核蛋白与细胞浆蛋白。BCA法测蛋白浓度定量。30 μg/孔蛋白上样,行SDS-PAGE胶(10%)电泳,电转至0.45 μm PVDF膜上。封闭液(碧云天)封闭2 h,加一抗4度孵育过夜,经TBST洗涤后再加入二抗(中杉金桥)室温孵育2 h,TBST洗涤后用ECL试剂盒(碧云天)曝光。实验结果以伯乐公司quantity one软件分析。实验独立重复三次。
1.4 统计学方法
用spss 23.0统计软件进行数据处理分析。组间比较采用独立t检验。P<0.05为有差异,P<0.01 为有明显差 异。
2 结果
2.1 患者肿瘤中心组织、瘤周组织、皮层造瘘脑组织中RANKL表达情况
肿瘤中心组织RANKL表达高于瘤周组织,有统计学差异(P=0.032);瘤周组织高于皮层造瘘脑组织,有统计学差异(P=0.024)(图1)。
图1 患者肿瘤中心组织、瘤周组织、皮层造瘘脑组织中RANKL表达情况(*P<0.05)
2.2 患者肿瘤中心组织、瘤周组织、皮层造瘘脑组织中RANK表达情况
瘤周组织RANK表达明显高于肿瘤中心组织,有统计学差异(P=0.006),肿瘤中心组织高于皮层造瘘脑组织,有统计学差异(P=0.028)(图2)。
图2 患者肿瘤中心组织、瘤周组织、皮层造瘘脑组织中RANK表达情况(*P<0.05,△P<0.01)
3 讨论
目前胶质母细胞瘤因其手术切除难度大、易复发、预后差等问题,成为了困扰医学界的难题。本研究中我们通过观察胶质母细胞瘤患者术中切除肿瘤中心组织、瘤周组织、脑组织标本来观察胶质母细胞瘤在侵袭过程中可能的机制。我们发现在肿瘤中心组织、瘤周组织、脑组织中均存在RANKL、RANK蛋白表达。而在肿瘤中心组织中RANKL表达明显高于瘤周组织、脑组织,而瘤周组织中RANK明显高于肿瘤中心组织、肿瘤中心组织高于脑组织。因此我们认为RANKL/RANK可能在胶质母细胞瘤侵袭中起到重要作用,并且胶质母细胞瘤可通过分泌RANKL促进瘤周组织微环境改变进而进一步促进胶质母细胞瘤侵袭。
脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤,且发病呈逐年上升的趋势[5],因其具有侵袭性生长的生物学特点,手术后肿瘤细胞容易残存、复发,患者生存期短。脑胶质瘤分为四级,目前多数研究者又将其分为低级别(Ⅰ-Ⅱ级)和高级别(Ⅲ-Ⅳ级)胶质瘤。其中50%以上为胶质母细胞瘤[6]。NCCN指南指出目前针对GBM患者的治疗包括最大范围的手术安全切除肿瘤、术后采用“STUPP方案”行替莫唑胺同步放、化疗以及辅助化疗[7]。尽管诊断和治疗有所改善,但胶质母细胞瘤仍然是最常见且无法治愈的中枢神经系统恶性肿瘤[8]。
有研究表明,RANK信号传导在骨重塑、免疫细胞、上皮细胞分化和肿瘤侵袭中起到重要作用[9]。RANKL是肿瘤坏死因子家族的成员,可以促进骨基质细胞释放骨保护因子骨保护素(osteoclastogenesis,OPG)。RANK也是肿瘤坏死因子家族的一员,是RANKL唯一的同源受体[10]。JING WANG等发现在子宫内膜癌组织中RANK表达明显比癌周组织升高,并且在外源性RANKL作用下子宫内膜癌细胞侵袭性增强[11]。在乳腺癌细胞中,特别对于HER-2阳性患者,使用邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)检测了RANK和HER-2之间的相互作用,并发现HER-2的表达影响RANK/HER-2二聚化数目进而影响肿瘤侵袭[12]。JUN-KYUM KIM等发现胶质母细胞瘤组织中RANKL激活星形胶质细胞,通过TGF-β促进神经胶质瘤细胞的侵袭[13]。前期我们在神经母细胞瘤体外侵袭实验中应用质粒转染技术发现,RANKL可以通过MMPs促进神经母细胞瘤迁移[14]。目前针对不同肿瘤组织的研究发现,在肿瘤中心组织、瘤周组织中,RANKL、RANK表达分别起作用[11,15-16]。而我们通过对胶质母细胞瘤患者切除的肿瘤中心组织、瘤周组织、脑组织研究发现,在胶质母细胞瘤肿瘤中心组织中,RANKL表达明显上调;而在瘤周组织中,RANK明显上调。
综上所述,我们发现胶质母细胞瘤中心组织中RANKL表达明显高于瘤周组织、脑组织,而瘤周组织中RANK明显高于肿瘤中心组织、肿瘤中心组织高于脑组织,我们认为可能机制为胶质母细胞瘤RANKL表达上调,从而促进胶质细胞RANK表达上调进一步促进胶质母细胞瘤侵袭,为下一步通过体外实验研究RANKL/RANK通路在胶质母细胞瘤侵袭中的作用机制提供指导依据。
[1] HUANG M,ZHANG D,WU JY,et al.Wnt-mediated endothelial transformation into mesenchymal stem cell-like cells induces chemoresistance in glioblastoma[J].sci Transl Med,2020,12(532):234-242.
[2] YU S,YU X,SUN L,et al.GBP2 enhances glioblastoma invasion through Stat3/fibronectin pathway[J].Oncogene,2020,39(27):5042-5055.
[3] WACHTER D,KALLENBERG K,WREDE A,et al.Fluorescence-guided operation in recurrent glioblastoma multiforme treated with bevacizumab-fluorescence of the noncontrast enhancing tumor tissue[J].J Neurol Surg A Cent Eur Neurosurg,2012,73(6):401-406.
[4] PÖLÖNEN P,JAWAHAR DEEN A,LEINONEN HM,et al.Nrf2 and SQSTM1/p62 jointly contribute to mesenchymal transition and invasion in glioblastoma[J].Oncogene,2019,38(50):7473-7490.
[5] DOLECEK TA,PROPP JM,STROUP NE,et al.CBTRUS statistical report:Primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009[J].Neuro Oncol,2012,15(5):646-647.
[6] JIANG L,ZHONG M,CHEN T,et al.Gene regulation network analysis reveals core genes associated with survival in glioblastoma multiforme[J].J Cell Mol Med,2020,24(17):10075-10087.
[7] TEJADA SOLIS S,PLANS AHICART G,IGLESIAS LOZANO I,et al.Glioblastoma treatment guidelines:Consensus by the Spanish Society of Neurosurgery Tumor Section[J].Neurocirugia (Astur),2020,5(34):357-368.
[8] KRIEGER TG,TIRIER SM,PARK J,et al.Modeling glioblastoma invasion using human brain organoids and single-cell transcriptomics[J].Neuro Oncol,2020,22(8):1138-1149.
[9] GONZÁLEZ-SUÁREZ,SANZ-MORENO.RANK as a therapeutic target in cancer[J].FEBS J,2016,283(11):2018-2033.
[10] VAN DAM PA,VERHOEVEN Y,TRINH XB,et al.The non-bone-related role of RANK/RANKL signaling in cancer[J].Adv Exp Med Biol,2020,12(77):53-62.
[11] JING WANG,XIAO SUN,HUIJUAN ZHANG,et al.MPA influences tumor cell proliferation,migration,and invasion induced by RANKL through PRB involving the MAPK pathway in endometrial cancer[J].Oncol Rep,2015,33(2):799-809.
[12] ZOI,XINGI,THOMAIDOU,et al.Dual targeting of RANKL/RANK pathway and HER-2 as a novel treatment strategy in HER-2 positive (+) breast carcinomas (BC)[J].Ann Oncol,2019,30(3):387-398.
[13] JUN-KYUM KIM,XIONG JIN,YOUNG-WOO SOHN,et al.Tumoral RANKL activates astrocytes that promote glioma cell invasion through cytokine signaling[J].Cancer Lett,2014,353(2):194-200.
[14] 王国文,张喆,吕海欣,等.RANKL/RANK通路介导神经母细胞瘤细胞迁移的机制探讨[J].现代肿瘤医学,2019,27(7):1118-1121.WANG GW,ZHANG Z,LYU HX,et al.Mechanism of neuroblastoma cell migration invasion by RANKL/RANK signaling pathway[J].Modern Oncology,2019,27(7):1118-1121.
[15] VARGAS G,BOUCHET M,BOUAZZA L,et al.ERRα promotes breast cancer cell dissemination to bone by increasing RANK expression in primary breast tumors[J].Oncogene,2019,38(7):950-964.
[16] KIM JK,JIN X,SOHN YW,et al.Tumoral RANKL activates astrocytes that promote glioma cell invasion through cytokine signaling[J].Cancer Lett,2014,353(2):194-200.