摘 要：目的：评价荧光定量PCR技术在女性生殖道人乳头状瘤病毒（HPV-DNA）中的检测价值。方法：收集2016年10月-2021年5月体检中心26 630例健康体检者、门诊12 521例及住院患者5 576例的宫颈分泌物，采用PCR荧光探针法进行HPV-DNA检测，对检测结果进行统计分析。结果：门诊患者与住院患者HPV感染率均高于健康体检者，差异有统计学意义（P<0.05）。健康体检者、门诊及住院患者荧光定量PCR法检出HPV感染7 860例，阳性率为17.57%；其中高危型2 542例（32.34%）、低危型5 318例（67.66%）；与病理活检结果比较，荧光定量PCR法检测高危型HPV阳性符合率为93.30%，阴性符合率为93.59%，总符合率为93.55%。结论：荧光定量PCR法是HPV-DNA有效的临床检测技术，在检测常见的高危型HPV方面有较好结果，可用于女性大规模体检初筛。
关键词：荧光定量PCR技术 人乳头状瘤病毒 宫颈肿瘤
宫颈癌为女性常见、多发恶性肿瘤，也是致女性死亡的主要疾病。尤其是近年来，宫颈癌在临床发病特点上又出现了一些新的变化，表现为患病者年龄呈年轻化、发病率不断增高[1]。因宫颈癌有较长的可逆性癌前病变期，因此，早发现、早治疗可以在很大程度上延长其存活时间，这也是临床重视并强调宫颈癌筛查与预防的出发点，通过有效筛查、降低宫颈癌发病率和致死率。人乳头状瘤病毒(HPV)是一种DNA肿瘤病毒，HPV感染是造成皮肤、黏膜良性或恶性病变的主要因素，很多肿瘤均与HPV感染相关[2]。随着临床对宫颈癌研究的深入，发现HPV感染与宫颈肿瘤之间也有密切关联。对HPV的检测，以往临床采用血清学检测方法、巴氏涂片、体外病毒培养基液基薄层细胞技术等方法，在一定程度上有操作复杂、主观性较大的缺点，使结果缺乏准确度，给HPV临床诊断和治疗造成一定影响。实时荧光定量PCR方法可以直接测定HPV的DNA，能够灵敏、快速地检出HPV的存在，是检测HPV的理想方法[3]。本研究采用荧光定量PCR技术对女性宫颈分泌物标本感染HPV的情况进行研究，评价该技术的临床应用价值，以期为大规模展开女性HPV-DNA筛查、预防宫颈癌发生提供参考。
资料与方法
搜集2016年10月-2021年5月敦煌市医院来自体检中心26 630例、门诊12 521例、住院患者5 576例研究对象的宫颈分泌物，总计44 727例；年龄18～57岁，平均年龄(37.5±19.5)岁。
方法：⑴仪器和试剂：全自动医用PCR分析仪(SLAN-96P)；检测试剂盒由圣湘生物科技股份有限公司提供。⑵标本采集：采集标本时，先用窥阴器/阴道张开器辅助宫颈暴露，用棉拭子把宫颈口位置过多的分泌物擦掉，宫颈刷放在宫颈口的位置，单方向转5圈，再把宫颈刷头部放入洗脱管，沿刷柄折痕位置折断宫颈刷柄，之后将洗脱管盖旋紧，送检。不能马上送检时，应放置在-20℃的环境下保存，并于7 d内完成检测。⑶检测方法：采用PCR荧光探针法检测：(1)DNA提取：洗脱宫颈刷，将洗脱液放入1.5 m L离心管，13 000 r/min，离心10 min，弃上清液，取50 m L裂解液加入其中悬浮、沉淀，使用沸水浴的方法加热10 min后，13 000 r/min，离心10 min，取上清液备用。(2)PCR扩增：严格按照说明书要求设置扩增参数，取20μL反应液加到5μL已经提取的待测样本DNA中，进行杂交与显色。(3)结果判读：结合膜条上蓝色斑点显现位置，对相应位置标记的基因型信息进行读取，只有1个基因型位点有蓝色斑点，表示相应基因型单一感染，多个基因型位点有蓝色斑点，表示相应基因型的混合感染；阴性质控品杂交膜条除了在IC位点有蓝色斑点，其他部位均无显色，阳性质控品必须保证在相应HPV基因型位点和IC位点有显色。⑷宫颈病变诊断：采用荧光定量PCR技术检测宫颈分泌物中HPV的起始病毒量，认为PCR结果拷贝数高于最低检测值，即50拷贝/m L者，为可疑阳性标本[4]。根据检测基因型将致病性分为高危型、低危型，高危型如HPV16、18、31、33、35等，低危型如HPV6、11、42、43等。⑸宫颈病理活检：对检测到上皮内病变的患者进行病理学检查，用活检钳取几小块组织，放于10%甲醛溶液中固定，送至病理科做切片，染色后于显微镜下观察、分析，得到病理诊断。(1)炎性与良性病变，如宫颈炎、宫颈肥大、息肉等；(2)宫颈上皮内瘤变(CIN)，有CINⅠ(轻度)、CINⅡ(中度)、CINⅢ(重度)；(3)浸润性宫颈癌。
观察指标：(1)比较门诊、住院患者与健康体检者HPV感染率；(2)统计荧光定量PCR法对高危HPV的检出率；(3)比较荧光定量PCR法检测高危型HPV结果与病理活检的符合率。
统计学处理：数据应用SPSS 25.0软件处理；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P<0.05为差异有统计学意义。
结果
门诊、住院患者与健康体检者HPV感染率比较：门诊12 521例患者中，检测HPV感染3 005例(24.00%)，其中多重感染876例(7.00%)；住院患者5 576例中，检测HPV感染1 394例(25.00%)，其中多重感染390例(6.99%)；体检中心26 630例健康者中，检测HPV感染3 461例(13.00%)，其中多重感染798例(3.00%)。门诊与住院患者HPV感染率高于健康体检者，差异有统计学意义(P<0.05)。
荧光定量PCR法检测高危HPV:44 727例研究对象中，荧光定量PCR法检出HPV感染7 860例，阳性率为17.57%；其中高危型2 542例(32.34%)、低危型5 318例(67.66%)。
荧光定量PCR法检测高危型HPV结果与病理活检的符合率：荧光定量PCR法检测高危型HPV阳性符合率为93.30%(362/388)，阴性符合率为93.59%(2 016/2 154)，总符合率为93.55%(2 378/2 542)。见表1。
表1 荧光定量PCR法检测高危型HPV结果与病理活检的符合率
讨论
目前已经发现的HPV亚型有百种之多，其中40多种常见HPV会造成女性生殖道感染，且高危型HPV的持续感染更是增加了宫颈癌发生的概率[5]。近年来，宫颈癌在全球的发生率均有所增加，是威胁广大女性生命安全的主要恶性肿瘤，对于本病的预防及治疗越来越重要，及早发现、及早预防和治疗对宫颈癌预后改善有重要作用。HPV感染作为宫颈癌发生的重要诱因，HPV检测已经被临床认为是预防肿瘤发生、控制肿瘤发展的重要方法。目前在很多医院的妇产科已经设立了高危型HPV检查，对女性宫颈组织行HPV-DNA检测可有效且及时地监控宫颈癌与癌前病变的发生、发展。通过采用荧光定量PCR检测HPV-DNA，不仅简单、易掌握，而且成本较低，医务工作者经过一段时间的学习和培训便可实践应用，普及性强。因此，采用荧光定量PCR检测HPV-DNA已经成为很多地区筛查宫颈癌的主要手段。
HPV感染之后使用传统的病毒培养方法与血清学检测难以及早发现，特别是女性性接触传播疾病患者的生殖道混合感染、宫颈糜烂等存在着HPV潜伏性感染。对于没有直观皮损或者是亚临床感染者，HPV能够通过寄生在受损宫颈上皮，使宫颈发生持续感染，再历经8～10年的时间，宫颈上皮便会发生不典型增生，导致发生程度各异的癌前病变，最终致癌变发生。随着医学实验技术的发展，HPV感染检查方法有了很大进步，其中荧光定量PCR技术是目前最常用也是非常灵敏的检测方法，该技术简单易行，将普通PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性以及光谱技术的高准确性有机结合，突出特异性强、灵敏度好、定量准确、速度快以及重复性好等诸多优点。较细胞学检查，采用PCR检测HPV-DNA的敏感度更高，其原因可能与信号放大作用有关。本研究中，采用PCR荧光探针定量检测，从搜集到的体检中心26 630例，门诊12 521例，住院患者5 576例，总计44 727人中，检测HPV阳性率为17.57%。通过对检测到上皮内病变的患者进行病理学检查，比较发现荧光定量PCR法检测高危型HPV阳性符合率为93.30%，阴性符合率为93.59%，总符合率为93.55%，检出率均较高。荧光探针PCR法能够检测14种常见的高危型HPV-DNA型，如HPV16、18、31、33、35等，大多数与宫颈癌有密切相关性。提示该检测方法在女性HPV-DNA筛查中有重要作用[6]。高危型HPV作为与宫颈癌病发有密切关系的因素，通过荧光定量PCR检测HPV，于PCR的基础上再结合荧光探针，使用核酸扩增检测试剂进行基因扩增反应，把HPV分型，从而实现对HPV早期、高效、简单的检测。在亚临床患者当中发现高危型阳性病例，继而有效管控癌前病变，通过定期随访，对发病者及时治疗，预防宫颈癌的发生，最大程度上避免宫颈癌的发展与扩散。
同时，荧光探针PCR法还有操作简单、检测快速且成本较低的优势，这些也决定了其适用于大规模人群的体检初筛[7]。但是应注意，对于一些低危型HPV感染引起的疾病检测，荧光探针PCR法尚有不足之处，可结合其他筛查手段进一步得到筛查结果[8]。
综上所述，荧光定量CPR法是HPV-DNA有效的临床检测技术，在检测常见的高危型HPV方面有较好结果，可用于女性大规模体检初筛。
参考文献
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[8]孟凡杰,童文珍,王健,等.流式细胞术联合荧光定量PCR精确检测HPV病毒载量在宫颈病变诊治中的应用研究[J].医学检验与临床,2019,30(4):1-3.