[摘要] 目的 研究猫爪草提取物钩藤碱对痴呆模型小白鼠学习记忆的干预作用。 方法 采用免疫组化分析及半定量反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）测定钩藤碱（rhynchophylline，RH）对快速老化痴呆型小白鼠（SAMP8）脑内β位点APP裂解酶（β-site APP cleavage enzyme，BACE）、β-淀粉样蛋白前体（β-site amyloid precursor protein，AβPP）及淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积表达。 结果 在小鼠探索实验中，SAMP8组小鼠停留原平台象限时间（18.59±7.72）s，穿越平台次数为（1.00±0.95）次，而钩藤碱中剂量组两组对应时间分别为（27.02±8.77）s和（2.30±1.07）次。与对照组相比，钩藤碱实验组痴呆模型小白鼠在原来的平台各象限中的驻留时间显著变长，且另一方面，该实验组小鼠穿越原来的平台的次数有明显的增加。进一步研究发现钩藤碱各剂量能明显降低SAMP8脑内Aβ平均光密度值和免疫阳性神经元数，如SAMP8组皮层Aβ平均光密度值和免疫阳性神经元细胞数分别为（0.326±0.094）和（69.91±9.31），而钩藤碱中剂量组对应值分别为（0.242±0.074）和（39.94±8.56）。且采用钩藤碱干预后，SAMP8小白鼠脑内BACE、APP mRNA含量也呈现下降趋势，如钩藤碱高剂量组AβPP mRNA表达值为（84.00±5.03），与SAMP8组对应值（110.11±30.51）。以上效应均呈现一定的量效关系。 结论 钩藤碱能较好地抑制APP裂解酶、β-淀粉样蛋白前体及淀粉样蛋白的过度生成，从而保护小鼠的神经元免受淀粉样蛋白的神经毒性影响，进而改善快速老化痴呆模型小白鼠SAMP8的学习记忆能力。
[关键词] 阿尔茨海默病；小鼠；记忆；猫爪草
[中图分类号] R749.16；R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）06-0012-07
Intervention of rhynchophylline on the learning and memory abilities of a dementia mouse model
ZHU Wenjuan1 CHENG Jinsheng2
1.Department of Pathology， the 1st People's Hospital of Huzhou City in Zhejiang Province， Huzhou 313000， China； 2.School of Medicine， Jiaying University， Meizhou 514031， China
[Abstract] Objective To research the intervention of rhynchophylline extracted from root of catclaw buttercup on the learning and memory abilities of a dementia mouse model. Methods The expressions of beta-site APP cleaving enzyme （BACE）， amyloid-β precursor protein（AβPP） and Aβ in senescence accelerated mouse prone 8（SAMP8） mouse brain were studied by immunohistochemical analysis and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） analysis etc. Results Comparing with the control group， in spatial exploration test of the RH-treated group， the staying time and the frequency of striding over primary terrace quadrant increased significantly. For example， the staying time of original platform and frequency of crossing original platform of SAMP8 group were（18.59±7.72） sec and（1.00±0.95） time， respectively. While for mid-dose of RH group， the data changed to（27.02±8.77） sec and（2.30±1.07） time， respectively. The Aβ mean optical density as well as the brain immunoreactive neurons of the RH cured group would decrease significantly comparing with SAMP8 group. For example， for SAMP8 group， mean optical density and the brain immunoreactive neurons were（0.326±0.094） and（69.91±9.31），while for mid-dose， mean optical density and the brain immunoreactive neurons would change to （0.242±0.074） and （39.94±8.56）. The mRNA contents of BACE and AβPP also decline after rhynchophylline intervention. For example， for high-dose RH goup， the AβPP mRNA expression was （84.00±5.03）， while for SAMP8 group， the data was （110.11±30.51）. All of these effects showed a dose-effect relationship. Conclusion All the results in this work indicate that rhynchophylline can improve the learning and memory abilities in SAMP8 by inhibit the expression of BACE， AβPP and Aβ in SAMP8 brain， leading to protection of the neurons from the nuerotoxicity of Aβ. 阿尔茨海默氏病（Alzheimer's disease，AD）的临床表现是患者的认知功能和记忆功能越来越差[1]。典型病理特征为脑部β淀粉样蛋白（Aβ）沉积并聚集形成老年斑（senile plaque，SP），且主要存在于与脑部与记忆和认知相关的特定区域[2]。进一步的研究表明，大量老年斑聚集、β淀粉样肽的大量变性沉积以及细胞内蛋白异常磷酸化导致的大量神经原的纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）其病患脑部的显著病理学特征[3，4]，这也是AD发病机制中重要的环节之一。诸多证据表明，包括上述Aβ沉积、神经纤维缠结等因素与AD的发病机制密切相关[5，6]。尽管西方国家已批准9-氨基四氢吖啶及石杉碱甲等药物用于阿尔茨海默氏病的治疗，但治疗效果仍不尽人意，有必要探索包括中草药在内的AD替代治疗方法[7]。
越来越多的临床证据显示，一些中草药对提升轻度至中度阿尔茨海默症患者的学习和记忆能力有很大帮助[8，9]。钩藤碱是由传统中药钩藤[来源于一些药用植物如钓钩藤10（Uncaria rhynchophylla，也称鱼钩藤，图1）和绒毛钩藤[11]（Uncaria tomentosa，也称猫爪草）等]中提取的一种生物碱，临床应用较多。钩藤碱属于非竞争性拮抗剂和钙离子通道阻断剂[12-15]。
目前，国内外已有中药干扰或治疗阿尔茨海默病相关研究[16-21]，但尚未见钩藤碱对阿尔茨海默病干扰相关研究。本工作探索通过凝胶电泳和免疫组化方法等技术研究钩藤碱对β淀粉样蛋白Aβ聚集体形成及Aβ纤维解聚的体外干预效应。观察钩藤碱对快速老化痴呆模型小白鼠SAMP8的学习记忆能力的改善效果。
1 资料与方法
1.1 动物来源
6月龄快速老化痴呆型小白鼠和正常老化小白鼠（SAMR1，雄性）由广州中医药大学第一附属医院提供，SPF级，体重18～22 g，所有动物实验均符合动物实验伦理准则。
1.2 试剂
一抗：β-淀粉样蛋白前体及兔抗大鼠多克隆抗体（购自Invitrogen公司）；二抗：即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒；DAB显色试剂盒购自Invitrogen公司；cDNA逆转录试剂盒和琼脂糖购自上海生工有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），石杉碱甲，Trizol试剂及PCR TaqMix由Gene Tech 公司购得；钩藤碱由嘉应学院医学院自制，纯度98.3%，钩藤碱标准品（纯度99%）由中国标准（成都）有限公司提供。
1.3 伦理声明
本工作包含的所有动物实验均符合国际动物伦理准则，并获得学校相关动物伦理委员会的批准（以书名报告的形式获得批准，审批编号为20140325）。本工作也是在广东省实验动物准则的规范下进行的。所有的实验均努力降低实验动物的使用数量以及它们所承受的痛苦度。
1.4 实验方法
1.4.1 分组方法 给药及研究试剂6月龄的快速老化痴呆型小白鼠（SAMP8，雄性）50只被随即平均分为SAMP8组、huperzine A（石杉碱甲）阳性对照组、RH（钩藤碱）低、中及高剂量组，共五组。10只6月龄正常老化小白鼠（雄性）设为另一个对照组（SAMR1对照组）。本研究中，快速老化痴呆型小白鼠对照组、正常老化小白鼠对照组喂服生理盐水，剂量为每千克30 mL；huperzine A阳性对照组喂服huperzine A每公斤0.02 mg；RH低剂量组：喂服钩藤碱剂量：每公斤45 mg；RH中剂量组：喂服钩藤碱剂量：每公斤90 mg；RH高剂量组：喂服钩藤碱剂量：每公斤180 mg；如上各实验组每天以灌胃方式给药一次，连续给药50 d。研究时间：2012年5月～2014年3月。
1.4.2 隐蔽性平台实验、探索性实验 隐蔽性平台实验：各实验组药物给药结束后，开展水迷宫（Morris）试验。所述水迷宫为一圆形池状结构，不锈钢材质，高度为50 cm，直径为100 cm，水温为22℃。该水迷宫共分为四个区域，被成为象限，本实验随即选择任何一个象限，居中放置一个直径10 cm的圆形小平台，并将平台沉于水下1 cm。上述装置上缘安装有与电脑链接的小型摄像机，并能随时跟踪小鼠的水下轨迹并实时分析。该隐蔽性平台实验共5 d，每天两次（上、下午各一次）。小鼠面向池壁，由相邻象限的圆池中间入池。通过摄像机记录小鼠在百秒内寻找到平台的时间。一旦该实验小鼠无法在规定的时间找到平台，将由研究员人工牵引到平台保持约10 s。相关数据（逃避潜伏期）被标记为100 s。每天记录两次，求平均值。
探索性试验：隐蔽性平台实验结束后，将上述平台去掉，将实验小鼠随机放入水中，观察在100 s内小鼠回想寻找其记忆中的平台的水中轨迹，并记下其穿越初始平台的次数以及在初始象限中游泳的时间（s）。
1.4.3 生物化学检测 免疫组化实验：上述实验结束后，将实验小鼠处死，在低温情况下快速取出实验小鼠的脑部组织，置于超低温冰箱中保存。每次对上述组织进行切片分析前，一次将其放入低温冰箱和4℃冰箱各30 min，随后用10%的福尔马林处理。经相关处理（包括脱水、浸蜡、包埋等）后，切为3 μm左右切片，并选用二甲苯进行脱蜡，并用酒精梯队水化处理。β淀粉样蛋白在柠檬酸缓冲溶液（pH值为6.0）修复抗原约90 s（在压力容器内加热至沸腾）。各切片滴加1滴上述溶液或者H2O2溶液（3%，50 μL），在室温下静置10 min。从而对活性内源性过氧化物酶进行有效阻断。各切片加50 μL的β-淀粉样蛋白前体和按1∶100稀释的淀粉样兔抗大鼠多克隆抗体，在常温冰箱保温层静置过夜。上述各切片采用50 μL的二抗（MaxvisionTM试剂盒）室温静置15 min。二氨基联苯胺显色，在显微镜下观察以控制时间。通过蒸馏水或去离子水及时洗涤以结束上述反应。采用Hematoxylin（苏木素）复染30 s，水洗涤、返蓝处理、乙醇梯度脱水处理、二甲苯脱蜡处理、树胶（中性）封片处理等，在显微镜下观察。 上述切片经二氨基联苯胺显色处理后，β淀粉样蛋白及β-淀粉样蛋白前体显黄色。采用磷酸缓冲液替代一抗（primary antibody），以作为实验的阴性对照。在β-淀粉样蛋白前体等染色切片的小鼠脑部皮层以及海马区域各取三个视野，采用病理切片分析系统分析各视野范围内β-淀粉样蛋白前体及淀粉样蛋白的光密度均值以及具有阳性的细胞数目。
1.4.4 采用逆转录PCR测定BACE和APP mRNA 按Trizol试剂说明提取细胞总RNA，并检测RNA完整性和纯度，利用cDNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。依据美国国家生物技术信息中心信息银行的小鼠脑内β位点APP裂解酶（BACE）、β-淀粉样蛋白前体（AβPP）及淀粉样蛋白（Aβ）的序列，以Primer premier 5.0软件（加拿大Premier公司）来设计各蛋白上下游的引物相应序列。
BACE上游引物为5’-TGGGCTTCTGTCTTGGAG--3’，下游引物为5’-TATG CGATGCGAATGTTT-3’；APP上游引物为5’- AGATTGCGATCG CGTACTCT-3’，下游引物为5’-GAT TTGATCGGCGATTATTG-3’；β-actin上游引物为5’-TAGCGCCCG TTGGTTGTCGT-3’，下游引物为5’-TTGACGCCTGATAGCTGCAGCC-3’，以上引物由上海生工生物工程公司合成。本工作利用上述设计的引物及PCR试剂盒各自合成β位点APP裂解酶（BACE）、β-淀粉样蛋白前体（AβPP）及淀粉样蛋白（Aβ）等基因。扩增反应条件：93℃预变性5 min，随后同样温度变性42 s。55℃退火50 s，70℃保持1 min。共32～36个循环。72℃继续延伸10 min。随后，吸取10 μL扩增产物于凝胶电泳（含溴酚蓝），参数设置为100福特，持续45 min。凝胶电泳完成红，采用Bio-Rad凝胶成像分析仪进行观察。并对PCR扩增后的片段的光密度进行扫描，得出相应的光密度积分值。此外，扫描相同产品的靶基因PCR扩增产物及内参的PCR扩增物的光密度，得出光密度比值一分析靶基因的表达水平。
1.4.5 钩藤碱的制备、纯化 钓钩藤等样品采自梅州阴那山，样品采集后经晒干、切段，粉碎及过筛（40 目，59.6 pm）等工序进行预处理。取1个100 mL烧杯，加入50 mL 80%乙醇，将样品（10 g）浸泡其中，并在-4℃冰箱静置12 h。随后将样品溶液超声1 h，旋转蒸发除去溶剂，收集棕色残留物。将该棕色样品在60℃真空干燥 24 h， 得到含有钩藤碱成分的钩藤总碱粗品（标记为RH-T）。
随后，将400 mg上述RH-T样品溶于10 mL甲醇，超声5 min，经0.22 μm尼龙微孔滤膜过滤，得棕色溶液（标记为RH-S）。
采用Waters 1525EF半制备型高效液相色谱仪对钩藤碱进行分离纯化，色谱柱：XTerra@Prep RP18 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），流动相：甲醇：0.01 mol/L 磷酸二氢钾（pH 8.0，以KOH调pH），体积比65∶35至 50∶50（时间30 min），流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长245 nm。样品注入量：130 μL。上述条件可以较好地将钩藤碱组分与异钩藤碱等其他碱分离开来。
收集保留时间在36.2～53.5 min范围内的钩藤组分，薄层色谱数据显示，该样品比移值为0.35（与钩藤碱标准品数据一致）。样品也分别用1H NMR（Bruker Advanced Ⅲ 500核磁共振仪，500 MHz，CDCl3为氘代试剂）、质谱（JEOL JMS-800D质谱仪）进行了详细表征，与钩藤碱的标准数据基本一致[12，13]。在上述表征结果基础上，重复上述HPLC分离实验过程20次，小心收集保留时间范围为36.2～53.5 min的所有钩藤碱组分，将该组分放置于-80℃冰箱内48 h，所得到的白色絮状固体用去离子水洗涤3次除去残留磷酸二氢钾，随后将洗涤后样品再次放入-80℃冰箱内24 h，得白色粉状钩藤碱固体，纯度为98.3% （HPLC）。
1.5 统计学方法
采用spss 17.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 钩藤碱表征数据
1H NMR（500 MHz，CDCl3，27℃）：δ0.723（m，3H），0.865（m，1H），1.185（m，1H），1.306（s，1H），1.603（t，1H），1.880（d，2H），2.221（m，3H），3.345（m，2H），3.567（d，2H），3.688（t，3H），6.844（s，3H），6.958（t，1H），7.103（m，1H），7.159（m，2H），7.190（m，1H），8.638（s，1H）； MS m/z 385（[M+H]+），384，383，353，170，149，148， 136，114。
2.2 小鼠隐蔽平台及探索性实验数据
2.2.1 隐蔽平台实验结果 研究指标为逃避性潜伏期参数（单位为s），给出的是对照组以及不同药物干扰后小白鼠5 d内逃避潜伏期数据。见表1。
2.2.2 小白鼠探索性实验结果 研究指标为停留原平台象限时间（单位为s）及穿越原平台次数（单位为次）等参数，给出的是不同实验组小白鼠停留原平台象限时间、穿越原平台次数数据。见表2。
2.3 免疫组化实验数据
不同实验组小白鼠脑部皮层Aβ在神经细胞的胞浆表达，见图2；不同实验组小白鼠大脑海马Aβ在神经细胞的胞浆表达，见图3。钩藤碱干扰对小白鼠脑部BACE mRNA、AβPP mRNA表达的影响，见图4。
