摘 要：目的 研究黄芪在高糖诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移中的作用及其机制。方法 取VSMCs随机分为对照组(普通培养)、高糖组(25mmol·L-1葡萄糖)、实验组(25 mmol·L-1葡萄糖+40μg·m L-1黄芪)、第1转染组(转染阴性对照寡核苷酸+25 mmol·L-1葡萄糖+40μg·ml-1黄芪)、第2转染组(转染miR-18a-5p模拟物+25 mmol·L-1葡萄糖+40μg·m L-1黄芪)。以细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞的存活率;以划痕实验检测细胞迁移情况;以实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测miR-18a-5p的表达;以蛋白质印迹法检测线粒体融合蛋白2 (MFN2)蛋白的表达。结果 对照组、高糖组和实验组VSMCs存活率分别为(100.00±10.00)%,(188.24±18.17)%和(123.52±12.66)%;VSMCs迁移率分别为(15.16±1.64)%,(53.63±5.27)%和(34.46±3.58)%;miR-18a-5p的表达分别为1.03±0.09,1.63±0.15和1.36±0.02;MFN2蛋白表达为1.05±0.12,0.34±0.07和0.73±0.09。以上数据，对照组和高糖组相比，高糖组和实验组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。此外，第1转染组和第2转染组中MFN2蛋白的表达量为0.69±0.08和0.43±0.06，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 黄芪通过调控miR-18a-5p/MFN2轴抑制高糖诱导的VSMCs增殖和迁移。
关键词：黄芪 微小RNA-18a-5p 线粒体融合蛋白2 高糖 血管平滑肌细胞 增殖
Effect of Astragalus membranaceus on proliferation and migration of vascular smooth muscle cells induced by high glucose
GAO Hui-juan JIANG Hai-hong
Department of Endocrinology,Daqing Oilfield General Hospital;
Abstract：Objective To investigate the role of Astragalus in the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (VSMCs)induced by high glucose and its mechanism.Methods VSMCs were randomly divided into control group (normal culture),high glucose group(25 mmol·L-1D-glucose),experimental group (25 mmol·L-1 D-glucose+40μg·mL-1 astragalus),transfection group 1 (transfection of negative control oligonucleotide+25 mmol·L-1 D-glucose+40μg·mL-1 astragalus),transfection group 2 (transfected with miR-18a-5p mimic+25 mmol·L-1D-glucose+40μg·mL-1 astragalus).Cell counting kit-8 (CCK-8) assay was used to detect cell proliferation;scratch assay was used to detect cell migration;real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR)analysis was used to detect the expression of miR-18a-5p;Western blot was used to detect mitochondrial fusion protein 2 (MFN2) protein expression.Results The inhibition rates of VSMCs proliferation in control group,high glucose group and experimental group were (100.00±10.00)%,(188.24±18.17)%and (123.52±12.66)%,respectively;the migration rates of VSMCs were (15.16±1.64)%,(53.63±5.27)%and (34.46±3.58)%,respectively;the expressions of miR-18a-5p were 1.03±0.09,1.63±0.15 and 1.36±0.02,respectively;MFN2 protein expression were 1.05±0.12,0.34±0.07 and0.73±0.09.For the above data,there was statistically significant difference between control group and high glucose group,between high glucose group and experimental group (all P<0.05).In addition,the expression of MFN2protein in transfection group 1 and transfection group 2 groups were 0.69±0.08 and 0.43±0.06,and the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion Astragalus inhibits high-glucose induced proliferation and migration of VSMCs by regulating the miR-18a-5p/MFN2 axis.
Keyword：Astragalus; microRNA-18a-5p; mitochondrial fusion protein 2; high glucose; vascular smooth muscle cells; proliferation;
糖尿病患者常见的并发症是血管病变，这也是造成患者死亡或残疾的重要因素[1]。成人血管平滑肌细胞(VSMCs)主要是维持血管收缩并调控血管管腔直径，以此调节血压的血流分布。在持续高糖状态下，可促进细胞增殖和迁移，迁移至血管内膜的VSMCs使血管内膜增厚、官腔狭窄，从而导致动脉粥样硬化的病变[2]。黄芪具有益气活血、利水消肿的功效，对高血压伴水肿、心肌缺血及糖尿病均有良好的治疗效果[3]。本文旨在研究黄芪对高糖诱导VSMCs增殖和迁移的影响，并分析其作用机制。
材料与方法
1 材料
细胞人VSMCs，购自美国模式菌种收集中心。
药品与试剂黄芪注射液，规格:每支10 mL(相当于原药材20 g)，批号:180527B2，批准文号:国药准字Z13020999，购自神威药业集团有限公司。细胞计数试剂盒(CCK-8)，购自上海碧云天有限公司;胎牛血清和DMEM培养基，均购自美国Gibco公司;实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒，购自美国Applied biosystems公司;聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白试剂盒，购自美国Thermo Fisher公司;抗线粒体融合蛋白2 (MFN2)抗体、抗β肌动蛋白(β-actin)抗体及蛋白质印迹检测试剂盒，均购自英国Abcam公司。
仪器ABI7500实时PCR仪，购自美国Applied Biosystems公司;Multiskan FC酶标仪，购自美国Thermo Fisher scientific公司;BX53荧光显微镜，购自日本Olympus公司。
2 实验方法
2.1 细胞培养
细胞放置于含10%胎牛血清的培养基中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养，培养24 h后，收集细胞用于实验。
2.2 细胞转染前分组及干预[4]
取对数生长期的细胞随机分为对照组、高糖组和实验组。对照组不用药物处理，高糖组用25 mmol·L-1的葡萄糖刺激24 h，实验组先用40μg·m L-1的黄芪孵育2 h再用25 mmol·L-1的葡萄糖刺激24 h，然后收集各组细胞进行后续实验。
2.3 细胞转染及转染后分组
按照参考文献[5]方法，将阴性对照寡核苷酸和miR-18a-5p模拟物分别转染至细胞中，随后使用40μg·m L-1黄芪及25 mmol·L-1葡萄糖处理，分别命名为第1转染组、第2转染组。
2.4 以CCK-8法检测VSMCs的增殖[6]
将各组VSMCs细胞接种于96孔板中，设置阴性对照组和空白对照组，待细胞贴壁后，加入黄芪进行处理。与细胞共培养48,72 h后，每孔加入CCK-8试剂10μL，并放置于37℃恒温培养箱中，继续培养4 h，之后使用酶标仪检测波长为450 nm处的光密度(OD)值。细胞存活率为实验组与对照组OD值的比值。
2.5 以划痕实验检测VSMCs的迁移情况[7]
细胞处理24 h后，用胰蛋白酶消化细胞，在6孔培养板背面每隔0.5 cm处画线，分别向每孔加入5×105个细胞，培养过夜，用移液器枪头垂直划痕，PBS溶液冲洗划下的细胞，置于37℃、5%CO2环境下培养，在0,24 h取样拍照，用Image J软件测量记录划痕宽度的变化。细胞迁移率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
2.6 以实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测miR-18a-5p的表达[8]
用Trizol试剂从培养的细胞中提取总RNA，根据说明书，使用第一链cDNA合成试剂盒(日本Takara)进行反转录以合成第一链cDNA。通过实时Qprusing SYBR预混料Ex-Taq试剂盒(日本Takara)检测基因表达。从MicroRNA RT-qPCR试剂盒中得知miR-18a-5p和U6引物，以GAPDH作为内参，用2-△△CT法计算相对表达量。miR-18a-5p引物序列为上游:5'-ACCGACCTTGAGGCATACTT-3'，下游:5'-GC-1CTACAGCCTCCTAGTACA-3';GAPDH引物为上游:5'CGACCACTTTGTCAAGCTCA 3'，下游:5'AGGGGTCTACATGGCAACTG 3'。反应条件:95℃进行预变性10 min,95℃进行变性20 s,60℃进行退火30 s，循环40次。每组分别设置5个复孔。
2.7 以蛋白质印迹(Western blot)法检测抗线粒体融合蛋白2(MFN2)蛋白的表达[9]
取对数生长期VSMCs细胞以2×106个/瓶接种于培养皿中，培养至传代时，使用预冷的PBS洗涤3次，向每组加入RIPA裂解液150μL，对细胞进行均匀吹打，放置于4℃摇床上进行裂解15 min，之后将细胞刮下，经超声振荡离心后提取总蛋白，用BCA蛋白测定试剂盒进行定量，对上样缓冲液均匀混合后，取蛋白40μg进行上样后，经5%浓缩胶和10%的分离胶进行SDS-PAGE电泳(1.5 h,250 m A)，于室温下封闭1 h。加入一抗抗体(1∶2 000)，经TBST冲洗3次后，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，室温下孵育1.5 h，进行ECL显影。用目的蛋白条带和内参的比值表示目的蛋白水平。
3 统计学处理
用spss 22.0软件进行统计分析。数据用表示，多组间比较用单因素方差分析，组间有差异使用LSD t检验进行两两比较。
结果
1黄芪对VSMCs增殖、存活和迁移的影响
与对照组比较，高糖组VSMCs细胞增殖能力、存活率和迁移能力显著增加，差异有统计学意义(P<0.01);与高糖组相比，实验组VSMCs增殖能力、存活率和迁移能力显著降低，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见表1。
2黄芪对miR-18a-5p表达水平的影响
对照组，高糖组和实验组miR-18a-5p的相对表达量分别为1.03±0.09,1.63±0.15和1.36±0.02。与对照组相比，高糖组中miR-18a-5p表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01);与高糖组相比，实验组miR-18a-5p表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。
3 各组MFN2蛋白表达的比较
Western blot结果显示，对照组，高糖组和实验组MFN2蛋白相对表达水平为1.05±0.12,0.34±0.07和0.73±0.09。对照组和高糖组相比，高糖组和实验组相比，差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05)。此外，第1转染组和第2转染组中MFN2蛋白的表达量为0.69±0.08和0.43±0.06，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图1。
讨论
近来研究表明，糖尿病及其血管并发症等疾病正威胁着人类的健康，因此改善此类疾病的发生及减轻疾病的症状对筛选和评价针对此类疾病的药物有着非常重要的意义[10]。
血管平滑肌细胞在调节血管功能、维持体内稳态环境起着重要的作用，血管平滑肌细胞的增殖与迁移是糖尿病心血管并发症如动脉粥样硬化及术后再狭窄的关键因素之一[11]。高糖作为糖尿病和高糖血症的独立的最直接的病因，影响着血管平滑肌细胞的功能[12]。VSMCs是血管壁的主要组成部分，病理状态下，VSMCs异常增殖可致动脉粥样硬化，因此，抑制VSMCs增殖和迁移是心血管疾病治疗的重点。
本研究显示，黄芪可显著降低高糖诱导的VSMCs增殖和迁移。进一步研究发现，黄芪可降低VSMCs中miR-18a-5p的表达从而上调MFN2的表达。
参考文献
[1] NOZUE T,FUKUI K,KOYAMA Y,et al. Effects of sitagliptin on coronary atherosclerosis in patients with type 2 diabetes-A serial integrated backscatter-intravascular ultrasound study[J]. Am J Cardiovasc Dis,2016,6(4):153-162.
[2]柴大军，许昌声，宁若冰，等. RXR激动剂通过抑制PKC激活对抗高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖[J].中国病理生理杂志，2013,29(2):266-271.
[3]冯妍，王以新，马涵英，等.冠状动脉粥样硬化性心脏病心力衰竭不同兼症及合并病中医治疗方案优化研究[J].中国医药，2020,15(8):1192-1196.
[4]贾新菊，康岩，杜丽娜，等.黄芪甲苷抑制NLRP3/IL-1β轴改善高糖诱导的血管平滑肌细胞炎症反应[J].上海中医药大学学报，2020,34(3):62-69.
[5]彭君，彭家清，秦鹏，等.和厚朴酚对高糖诱导的足细胞氧化应激及凋亡的影响[J].中国临床药理学杂志，2020,36(13):1870-1874.
[6]蔡礼权，黄念来，张小路，等.微小RNA-218对大鼠膝骨关节炎细胞的增殖与凋亡调控作用机制研究[J].中国临床药理学杂志，2020,36(22):3704-3708.
[7]袁青领，樊玉霞，刘洋，等. miR-637靶向AKT3对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞侵袭和转移能力的影响[J].郑州大学学报(医学版)，2021,56(2):149-153.
[8]袁晟，陈栋，丘晨，等.姜黄素介导微小RNA-199a-3p基因对前列腺癌细胞的影响[J].中国临床药理学杂志，2021,37(2):124-127,132.
[9]晁荣，胡晓燕，朱生东，等.苦参碱联合化疗药物对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖及侵袭力的影响[J].世界中医药，2019,14(11):2910-2913.
[10]张清楠.血管平滑肌细胞在高糖诱导下增殖迁移过程的监测及应用[D].浙江杭州:浙江大学，2006.
[11]楚海荣，李宏，吴海燕，等.高糖对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响及其机制[J].中国动脉硬化杂志，2014,22(11):1097-1100.
[12]张静，楚海荣，郭英，等.高糖对大鼠血管平滑肌细胞表型转化的影响及其机制[J].中国应用生理学杂志，2015,31(5):458-461.