马麟 梁永 枢段启
【摘要】目的优选四妙勇安汤组方提取工艺。 方法以绿原酸和哈巴俄苷两种成分含量之和为考察指标，采用L9（34）正交试验设计筛选最佳提取工艺，测定方法采用HPLC法。 结果 以两种成分含量之和计，正交试验各因素对实验结果影响大小为提取溶剂>提取次数>溶剂量>提取时间。 结论 四妙勇安汤最佳提取工艺为用10倍量50%乙醇回流1 h，提取3次。
【关键词】四妙勇安汤 提取工艺 正交试验 绿原酸 哈巴俄苷
四妙勇安汤始载于清代鲍相敖著《验方新编》中，为治疗热毒型脱疽的经典古方，由金银花、玄参、当归、甘草4味药（3∶3∶2∶1）组成，具有滋阴降火、和营解毒的功效，在现代临床广泛应用于血栓闭塞性脉管炎等周围血管病的治疗［1］。因此，将本方研制成新的中药制剂具有良好的临床应用前景。在本组方中，绿原酸和哈巴俄苷分别为君药金银花和玄参的主要有效成分［2］，是制剂工艺优选和质量控制的主要指标。目前，该方中尚没有同时测定这2个成分的报道。本文建立了用高效液相色谱法(HPLC)同时测定本方中绿原酸和哈巴俄苷含量的分析方法，并以2种成分含量之和为考擦指标，采用L9（34）正交试验法优化其提取工艺，为本方的新药开发研究奠定良好的基础。
1仪器与试药
1.1仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪(SPD-M20A二极管阵列检测器、LC solution数据处理系统)，超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
1.2试药金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾，玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根，当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根，甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fischer的干燥根及根茎。以上药材均购自四川新荷花中药饮片有限公司，由成都中医药大学中药学院付强博士鉴定。绿原酸（批号：110753-201314）和哈巴俄苷（批号：111730-201307）对照品购自中国食品药品检定研究院。
1.3试剂甲醇和乙腈（MERCK公司产品），乙醇和磷酸（国药集团上海化学试剂公司），分析纯，上海Millipore纯水系统。
2方法
2.1干膏的制备
取四妙勇安提取液，置水浴上蒸干，于真空干燥箱中60 ℃烘至恒重，取出，置干燥器中冷却，即得。
2.2含量测定
2.2.1色谱条件：Angilent XDB-C18色谱柱（250×4.6 mm, 5 μm），流动相为乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱，流动相组成见表1，流速1.0 ml·min-1，检测波长270 nm；柱温：30 ℃，进样量10 μl，在该色谱条件下，样品中主要成分能够达到基线分离，相邻色谱峰的分离度符合要求。色谱图见图1。
2.2.2对照品溶液的制备分别精密称取绿原酸对照品10 mg、哈巴俄苷对照品10 mg置于25 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，作为贮备液，精密量取该贮备液1 ml，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，分别制成浓度为0.040 mg·ml-1的对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备取四妙勇安汤干膏适量（相当于生药3.0 g），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 ml 50%甲醇，振摇使溶解，精密量取2 ml置10 ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，滤过，即得。
2.2.4标准曲线制备及线性关系考察精密量取上述绿原酸和哈巴俄苷对照品贮备液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 ml，分别置于10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，进样，以峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，得回归方程、线性范围及相关系数，结果见表2。
2.2.5精密度试验
取同一对照品溶液重复进样6次，每次10 μl，分别测定绿原酸和哈巴俄苷峰面积，所测峰面积的RSD分别为0.6%和0.9%，表明该仪器精密度良好。
2.2.6重复性试验取同一批样品，分别制备6份供试品溶液，测定绿原酸和哈巴俄苷峰面积，计算含量，测定结果的RSD分别为0.7%、1.0%，表明该方法的重复性良好。
2.2.7稳定性试验
取同一供试品溶液分别在0、4、8、12、24、48 h进样，测定峰面积。结果表明，供试品溶液在48 h内稳定性良好，绿原酸和哈巴俄苷峰面积的RSD分别为1.1%和1.3%。
3结果
3.1正交试验设计因素水平确定
根据上述单因素考察结果，按处方比例取金银花药材等约90 g，精密称定，电热套回流提取条件下，选取提取溶剂、提取时间、溶剂量、提取次数四因素，每个因素选择3个水平设计提取工艺。见表3。
3.2正交试验设计及结果
按表3进行试验，每个试验号平行3份，按2.1项及2.2.1项下制备供试品，HPLC法测定绿原酸和哈巴俄苷的含量，以2种有效成分之和为考察指标，结果见表4和表5。
4讨论
四妙勇安汤的4味组成药材均为中国药典收录品种［2］，药典相关品种项下均有含量测定。本方的金银花和玄参为君药，本研究测定的绿原酸和哈巴俄苷分别为药典收录的金银花和玄参项下含量测定指标之一，考察此二者的含量之和应能达到测定其有效成分的目的。
有关四妙勇安汤的HPLC法测定已经有少数报道［3-5］，但同时测定绿原酸和哈巴俄苷的尚属首次。HPLC法的条件主要参考中国药典一部金银花和玄参项目绿原酸和哈巴俄苷的色谱条件，并综合照顾到二者同时测定，做了适当的调整。检测波长选为270 nm主要是二者均有较强吸收峰，灵敏度较好。
正交设计是优化制剂工艺的有效方法，该法方便、准确，可减少试验次数，节省试验时间和费用［6-7］。本试验中的正交设计是根据药物特性及预实验结果等因素综合确定的。分析试验结果，由表4和表5可知，影响四妙勇安汤提取工艺的最大因素是提取溶剂，其影响因素主次关系为提取溶剂>提取次数>溶剂量>提取时间，其最佳提取工艺是A2B2C3D3。
本方作为效果良好的经典古方，具有较大的开发价值。本研究所建立的方法可作为该方进一步进行制剂工艺研究和质量控制研究的基础。
［1］
彭怀仁,项平.中医方剂大辞典精选本［M］.北京:人民卫生出版社,1999:492.
［2］国家药典委员会.中国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社,2010:80-81,108-109,124-125,205-206.
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［4］余国祥,茆玉国,雷群忠,等.HPLC法测定四妙勇安汤中绿原酸的含量［J］.解放军药学学报,2007,23(3):304-305.
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