杨群芳 严伟玲
【摘要】目的探讨miR-10a、miR-93和miR-200a在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其临床意义。方法采用实时定量PCR仪检测40例正常卵巢组织、40例卵巢良性囊肿组织和40例卵巢恶性肿瘤组织中miR-10a、miR-93和miR-200a表达情况，miR在不同组织中表达的比较采用方差分析，t检验分析miR与卵巢恶性肿瘤临床病理特征的关系，预后分析采用Kaplan-Meier法log-rank检验和Cox比例风险回归模型。结果miR-10a在卵巢恶性肿瘤组织中的表达显著高于正常卵巢组织和卵巢良性囊肿组织（p<0.001），miR-93和miR-200a在三组织中的表达差异均无统计学意义（p>0.05）；miR-10a表达量在有大网膜转移、淋巴结转移和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤组织中显著高于无转移者（p<0.05）。卵巢恶性肿瘤组织miR-10a高表达的患者比低表达的患者中位生存时间更短，差异具有统计学意义（p=0.01）；Cox模型多因素分析显示，miR-10a表达量是影响患者生存预后的独立因素（p=0.002）。结论miR-10a表达与卵巢癌转移有关，是影响卵巢癌预后的主要因素，可以作为判断卵巢癌预后的标志物。
【关键词】卵巢恶性肿瘤 miR-10a 转移预后
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2014.07.030
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，死亡率高居女性恶性肿瘤第四位，并有逐年上升的趋势。因此提高卵巢癌患者早期诊断以及改善其预后水平非常重要［1］。微小RNA（micro-RNA，miRNA）是一类高度保守的非编码小分子单链RNA，其通过调节信使RNA表达活性在转录水平调控靶基因的表达，从而参与细胞生长、发育、分化和增殖等多个生命过程［2-3］。有研究表明miR-10a、miR-93和miR-200a通过影响其靶基因的表达，从而参与肿瘤的发生、发展和预后［4-6］。miR-10a、miR-93和miR-200a在肿瘤组织中存在异常表达的情况，同时有研究证实miR-10a的表达与肿瘤的转移有密切关系［7］。本研究探讨miR-10a、miR-93和miR-200a在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其与卵巢癌临床病理参数及预后的关系，确认其能否作为判断卵巢癌预后的标志物。
1对象与方法
1.1研究对象
选择某医院妇产科2007年6月~2012年12月行卵巢手术治疗的患者，患者切除的卵巢组织均经过严格的病理学检查确诊。其中正常卵巢组织40例，年龄26~58岁，平均42.8岁，均为子宫肌瘤病人行卵巢切除术，病理检查无异常。卵巢良性肿瘤40例，年龄21~63岁，平均43.5岁，包括卵巢黏液性瘤14例，卵巢浆液性瘤22例，畸胎瘤6例。卵巢恶性肿瘤40例，均为有完整随访资料的原发性卵巢癌患者，年龄35~72岁，平均44.3岁；按照世界卫生组织（WHO，1973）卵巢癌组织学分类标准，30例为上皮细胞肿瘤，6例为生殖细胞肿瘤，4例性索间质肿瘤；按照国际妇产联盟（FIGO2009）标准，Ⅰ期4例，Ⅱ期20例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例；低分化癌21例，高分化癌19例；所有卵巢癌患者均行卵巢切除术和肿瘤减灭术，同时30例上皮细胞肿瘤术后接受顺铂+紫杉醇，10例其他性肿瘤术后行顺铂+博来霉素+长春新碱联合化疗。治疗后每3个月通过电话对卵巢癌患者或其家属进行随访，随访至2013年6月，中位随访时间为38个月（6~60个月）。
1.2卵巢组织中提取RNA
将卵巢组织标本从液氮中取出后放于冰上完全解冻，然后用预冷的PBS液洗涤标本2次，再放于研钵中加入1 ml Trizol液充分研磨，研磨充分后加入0.2 ml氯仿，充分混合后取上层水相再加入0.5 ml异丙醇，12 000 g离心10 min，弃去上清液于加入0.75 ml乙醇涡旋混匀后，4 ℃下7 500 g离心5 min，再次弃去上清液于室温干燥5 min，最后用DEPC水溶解。检测RNA溶液D260/D280吸光值，吸光值介于1.8~2.1时提取的RNA溶液才可用于cDNA合成。将合格的RNA溶液于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.3cDNA合成和实时荧光定量PCR
将合格的RNA溶液使用天根cDNA合成试剂盒（TIANscript RT Kit）进行cDNA合成，具体操作步骤见试剂盒说明书，简要叙述如下：4 ul 5×缓冲液、2 ul酶混合物、10 ul RNA酶灭活水和4 ul RNA溶液配制成20 ul体系，先在42 ℃下反应60 min，再95 ℃下反应5 min。将反应生成的cDNA 8 ul、SYBR Green master mix （miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR）10 ul、PCR混合液2 ul共20 ul在实时荧光定量PCR仪（ABI7500）进行扩增，反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s,56 ℃延伸30 s，72 ℃退火45 s，以上相同条件循环40次。每例标本进行复孔检测两次，记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数为Ct值，两次检测的Ct值取平均值作为每例样本的最终Ct值，同时以U6snRNA作为内参其检测Ct值，目标mRNA表达量=2-△Ct，其中△Ct=CtmiR-CtU6。
1.4统计学方法
本文所有的统计分析均采用spss 21.0统计软件进行。对样本miR表达量等定量资料采用正态性检验，资料为正态分布，故使用均数±标准差表示，三组样本间miR表达量的比较采用方差分析LSD法两两比较；两组样本间miR表达量比较采用t检验；采用Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线，生存曲线两组间比较采用log-rank检验；采用Cox比例风险回归模型进行生存资料的多因素分析。所有检验均为双侧检验，p<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1miR-10a、miR-93和miR-200a在正常卵巢组织、卵巢良性囊肿组织和卵巢恶性肿瘤组织中的表达
miR-10a在卵巢恶性肿瘤组织中的表达量高于正常卵巢组织和卵巢良性囊肿组织中的表达量，差异均具有统计学意义（p<0.001）；miR-10a在正常卵巢组织和卵巢良性组织中的表达量差异无统计学意义（p>0.05）；miR-93和miR-200a在正常卵巢组织、卵巢良性囊肿组织和卵巢恶性肿瘤组织中的表达量差异均无统计学意义（p>0.05）,见表1。
2.2卵巢恶性肿瘤组织中的miR-10a、miR-93和miR-200a表达量与临床病理特征的关系
miR-10a表达量在有大网膜转移、淋巴结转移和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤组织中高于无转移者，差异均具有统计学意义（p<0.05）；miR-10a表达量与卵巢恶性肿瘤细胞类型、临床分期、分化程度、腹水量和是否有铂类耐药无明显相关性，差异均无统计血液意义（p>0.05）；miR-93和miR-200a表达量卵巢恶性肿瘤细胞类型、临床分期、分化程度、是否有大网膜转移、是否有淋巴结转移、是否有远处器官转移、腹水量和是否有铂类耐药等临床病理特征均无明显相关性，差异均无统计学意义（p>0.05），见表2。
2.3卵巢恶性肿瘤组织中的miR-10a表达量与患者预后的关系
以miR-10a表达量的中位数22.14作为截断值，将miR-10a表达水平分为高表达组（>22.14）和低表达组（<22.14），使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验显示miR-10a高表达组患者的中位生存时间为29.40个月，miR-10a低表达组患者的中位生存时间为49.35个月，差异具有统计学意义（p=0.01）（图1）。采用Cox比例风险回归模型分析显示，临床分期、分化程度、远处器官转移和miR-10a表达量是卵巢癌患者预后的独立危险因素（p<0.05）；卵巢恶性肿瘤组织中miR-10a表达量越高，患者预后越差。
3讨论
Long MJ等［7］发现miR-10a在人类宫颈癌组织中显著上调，同时在Hela细胞和C33A细胞中观察到miR-10a可以促进细胞菌落的形成，迁移和侵袭。敲除CHL1基因的Hela细胞和C33A细胞，会增强细胞菌落的形成，迁移和侵袭能力，同时研究证实CHL1基因是miR-10a的靶基因，miR-10a会下调CHL1基因mRNA水平以及CHL1蛋白水平。Wang L等［8］发现miR-93和miR-200a在宫颈癌组织中也是显著增加，并且与肿瘤的转移和侵袭性有关。本研究经过方差分析发现，miR-10a在卵巢恶性肿瘤组织中的表达量显著高于正常卵巢组织和卵巢良性囊肿组织中的表达量，而miR-93和miR-200a在正常卵巢组织、卵巢良性囊肿组织和卵巢恶性肿瘤组织中的表达量差异均无统计学意义。miR-10a的结果与前人研究是一致的，但是miR-93和miR-200a并没有观察到这种变化，可能的原因是我们的样本量太小，没有达到检验出差异的效能；或者miR-93和miR-200a表达具有组织特异性，其只有在特定的肿瘤组织中才具有差异化表达。
Yan Y等［9］研究发现miR-10a通过抑制酪氨酸激酶A4受体的表达，介导原发性肝癌细胞的转移和侵袭。Long MJ等［7］发现敲除CHL1基因的Hela细胞和C33A细胞，会增强细胞菌落的形成，迁移和侵袭能力，同时研究发现CHL1基因是miR-10a的靶基因，miR-10a会下调CHL1基因mRNA水平以及CHL1蛋白水平。因此众多研究都证实miR-10a
通过抑制其靶基因的表达，参与了肿瘤的转移和侵袭。我们的研究同样发现miR-10a表达量在有大网膜转移、淋巴结转移和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤组织中高于无转移者，差异均具有统计学意义，这与上述肿瘤细胞学研究的结果时一致的。另外我们的研究还发现卵巢恶性肿瘤组织miR-10a高表达的患者比低表达的患者中位生存时间更短，Cox模型多因素分析显示，miR-10a表达量是影响患者生存预后的独立因素。其原因是高水平的miR-10a导致了卵巢恶性肿瘤细胞的转移，以及对周围和远处器官的侵袭，导致癌细胞扩散至全身，从而加速了病情以及增加了治疗难度。
总之，miR-10a表达与卵巢癌转移有关，是影响卵巢癌预后的主要因素，可以作为判断卵巢癌预后的标志物。
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