摘 要： 外泌体是一种由绝大多数细胞分泌的微小囊泡，在体内生理以及病理过程中发挥重要作用。发生排斥反应的肺移植受者(LTxR)循环外泌体中含有不匹配的人类白细胞抗原(HLA)和肺相关自身抗原(如K-α1微管蛋白和胶原蛋白V)等，外泌体可能是由自身抗体诱导产生的，循环中的外泌体引发免疫反应，导致肺移植受者发生排斥反应。本文从3个方面讨论外泌体在肺移植中的作用:外泌体作为肺移植后发生排斥反应的生物标志物;外泌体介导的激活免疫反应的机制;外泌体作为治疗策略的潜在能力。
关键词 : 肺移植;外泌体; HL A抗原;移植物排斥;生物学标记;
Abstract： Exosomes are tiny vesicles secreted by most cells and play an important role in physiological and pathological processes in vivo. The circulating exosomes of rejected lung transplant recipients( LTxR) contain mismatched human leukocyte antigens( HLA) and lung associated autoantigens( such as K-α1 tubulin and collagen V),etc.,exosomes may be induced by antibodies to autoantigens,and these circulating exosomes trigger immune response that leads to rejection in lung transplant recipients. Here,we will discuss the role of exosomes in lung transplantation from three aspects: exosomes as biomarkers of lung transplantation rejection; Exosome mediated activation of immune response mechanisms; the potential of exosomes as therapeutic strategies.
Keyword： Lung transplantation; Exosomes; HLA antigens; Graft rejection; Biomarkers;
1、 外泌体
细胞外囊泡(EVs)是由细胞分泌的各种具有双层膜结构的囊泡的统称。细胞外囊泡可分为4个亚群:外泌体、微粒(微囊泡)、凋亡小体和癌小体，而目前研究点主要集中在外泌体[1]。外泌体是由细胞内溶酶体反向出芽形成的杯状囊泡，40～100 nm，通过与质膜融合从细胞中释放出来[2]。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。大多数细胞都可以分泌外泌体，例如肥大细胞、树突状细胞、T和B淋巴细胞、间充质干细胞、脂肪细胞、内皮细胞和上皮细胞等等[3]。并且在多种体液，如血液、尿液、腹水、母乳、唾液、羊水、淋巴液和支气管肺泡灌洗液(BALF)等中都发现了外泌体[4]。外泌体含有多种生物分子，包括糖类、蛋白质、脂类、核酸(即DNA和RNA)和代谢物等[5]。根据目前的外泌体内容数据库Exocarta，各种生物和细胞类型的外泌体含有41 860种蛋白质、3 408种mRNA、2 838种microRNA(miRNA)和1 116种脂质。
外泌体的组成取决于其来源的细胞，如器官移植、超敏反应、癌症、感染性疾病和其他病理条件下，循环外泌体的表面标志物和内含物都不相同。肺移植受者(LTxRs)中的循环外泌体存在组织相关自身抗原(SAgs)———K-α1微管蛋白(Ka1T)和胶原蛋白V (Col-V)、共刺激分子、转录因子核因子κB(NF-κB)、缺氧诱导因子(HIF)、20S蛋白酶体、MHCⅡ类分子和其转录因子CIITA等[6]。通过研究外泌体的生物成分，对理解其在移植排斥反应中的作用至关重要。有研究[6]表明，小鼠对肾SAg基底膜聚糖的体液免疫反应是由外泌体中存在的20S蛋白酶体引起的，20S蛋白酶体失活后，小鼠对肾的自身免疫性反应也将消失。外泌体中含有丰富的生物成分，可作为生物标志物监测移植排斥反应、疾病进展和预后状况等，将会有光明的应用前景;同时外泌体作为抗原提呈囊泡(APVs)，参与肺移植(LTx)后的固有免疫和适应性免疫应答;外泌体具有递送生物分子的功能，还有发展成为临床药物递送载体的潜力。2013年诺贝尔生理学或医学奖被授予了发现囊泡运输调控机制的研究人员，强调了外泌体对生物学领域的影响。
2、 外泌体是重要的生物标志物
对于许多被诊断为终末期肺疾病的患者来说，LTx是唯一的治疗措施[7]。根据国际心肺移植协会的登记报告显示，截至2017年6月30日，全球已有67 260例LTx手术。随着医疗技术和免疫抑制的不断发展，LTx越来越成熟，但术后仍会出现很多并发症，像感染、急性排斥反应(AR)、慢性排斥反应(CR)、急性肺水肿和心血管疾病等等。其中CR在LTx术后最为常见，5年内发生率约为50%,10年内发生率可达90%[4]。CR中慢性同种异体肺移植功能障碍(CLAD)导致的肺衰竭是移植后一年内死亡的主要原因[8]。CLAD包括闭塞性细支气管炎综合征(BOS)和限制性同种异体肺移植综合征2种亚型[4,9]。BOS是CLAD最常见的临床表现，大约70%的CLAD患者会发生BOS[9]。
LTx术后，临床医生通过支气管镜活检、影像学检查等方法监测排斥反应。然而，这些方法缺乏准确性、特异性，常常反映移植肺损伤的非早期。因此，在LTx领域迫切需要开发新的诊断生物标志物，对同种异体LTx进行无创和连续监测。发生排斥反应与否的LTxRs外泌体的主要成分不同，其有望成为同种异体移植排斥反应的预测/诊断生物标志物。
2.1、外泌体———肺相关自身抗原
发生排斥反应的主要原因是异体移植物与受者人类白细胞抗原(HLA)不匹配，被受者的免疫监测所识别。Sureshbabu等[9]报道诊断为AR和CR的LTxRs血清和BALF中存在外泌体，这些外泌体携带有特异性抗原，参与了同种异体LTx的排斥反应。原发性移植物功能障碍(PGD)、缺血再灌注损伤、呼吸道病毒感染(RVI)、供者特异性抗体(DSA)和肺相关SAgs(Ka1T和Col-V)抗体的产生等会诱导循环外泌体的释放[4]。CLAD患者的循环外泌体表达:与受者错配的HLA分子、肺相关SAgs、共刺激分子(CD80,CD86)、转录因子NF-κβ、HIF-1α、microRNA (miR-NA)和20S蛋白酶体等[6]。Gunasekaran等[10]研究发现非排斥患者的外泌体不表达MHCⅡ类分子和共刺激分子(CD80、CD86、CD40)，但黏附分子在LTxRs的循环外泌体上都有表达。
HLA分子和(或)肺相关SAgs抗体的产生是预测排斥反应的标志。在发生排斥反应的LTxRs中，在供者来源的外泌体表面检测到供者HLA和SAgs，在稳定性LTxRs的供者来源的外泌体上没有检测到SAgs，表明循环外泌体来源于免疫损伤后的移植器官[9,11]。供者来源的外泌体从移植物中“渗漏”出来，并通过受者毛细淋巴管外渗或切断的开口向移植物引流的淋巴器官流动。Habertheuer等[7]将Wistar转基因鼠的左肺移植到MHC分子完全不匹配的Lewis受者中，GFP标记CD63检测外泌体水平，循环外泌体在第1天达到峰值，第2天显着下降，然后在第3天达到基线水平，符合AR的表现。外泌体水平快速下降，发生在移植出现AR的组织学证据之前，提示外泌体可以作为一种新的生物标志物。
Rahman等[12]在原位单侧LTx CR的小鼠模型中，观察到超过80%的移植小鼠从第14天开始，血清中分离的外泌体显示肺SAgs(Col-V和Ka1T)水平升高，血清中还存在抗肺SAgs的抗体，而在第30天才出现CR的组织学变化，表明外泌体可能是CR的潜在生物标志物，并推测外泌体可能参与了LTx后CR的发生。Sharma等[13]研究表明，在BOS临床诊断前12个月，从血浆中分离的外泌体显示肺SAgs(Ka1T和Col-V)水平的升高(特异性为100%，敏感性为90%)，表明带有肺SAgs的循环外泌体可作为鉴别有BOS风险的LTxRs生物标志物。Mohanakumar等[14]用BOS患者的循环外泌体(添加佐剂)免疫小鼠，供者气道上皮细胞(AEC)分泌的外泌体具有高度免疫原性，含有HLAⅡ类分子、20S蛋白酶体和共刺激分子等，小鼠脾脏T细胞对外泌体上两种SAgs(Ka1T和Col-V)均有反应，γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素17(IL-17)生成增加，白细胞介素10(IL-10)水平降低。因此，AEC分泌的外泌体会增强LTx后的免疫反应，导致排斥反应的发生。
棒状细胞分泌蛋白(CCSP)具有抗炎功能，在吸烟、感染、肺损伤、BOS和其他可导致炎症反应的疾病中，CCSP水平下降。据Itabashi等[15]报道，在BOS临床诊断前7～9个月，患者BALF中CCSP水平显着下降，低水平的CCSP可以促进促炎细胞因子的产生、自然杀伤细胞(NK细胞)来源外泌体的诱导以及对HLA和SAgs的免疫反应，NK细胞来源的外泌体含有增加的SAgs、NK细胞标志物和细胞毒性分子，提示NK细胞来源的外泌体在CLAD发生中发挥作用。CCSP缺失导致NK细胞释放外泌体，能够刺激移植后固有免疫和适应性免疫应答，增加了BOS的风险。
Goodlet等[16]报告，1例76岁的女性肺移植患者，因AR接受免疫抑制剂治疗后，随后感染了SARS-Co V-2,HLA抗体水平开始急剧增加。在SARS-Co V-2感染前，对循环外泌体分析显示存在肺SAgs、HLA-DR和HLA-DQ。患者感染SARS-Co V-2后，发现外泌体含有SARS-Co V-2刺突蛋白，感染症状消除后，不再检测到含有SARS-Co V-2刺突蛋白的外泌体，然而，具有肺SAgs、HLA-DR和HLA-DQ的外泌体始终存在，肺功能持续下降，提示患者出现CLAD。以上表明，检测含有病毒蛋白的外泌体可能有助于识别由病毒感染引起的同种异体移植物损伤。
抗HLA和抗肺相关SAgs可能在BOS的免疫发病机制中发挥协同作用，并且是BOS进展的重要预测因子[17]。大多数产生DSA的患者随后也会产生肺相关SAgs抗体，表明DSA可能会激活并诱导肺相关SAgs抗体的产生[18]。Sureshbabu等[9]对103例LTxRs的分析表明，42.7%的LTxRs产生了DSA,30.1%的LTxRs产生了Kα1T和Col V抗体，表明DSA的产生通常先于肺SAgs抗体的产生。此外，HLA抗原和肺相关SAgs，彼此相互影响产生抗体的概率更大，提示存在免疫扩散现象。研究表明肺相关SAg(Kα1T)不仅可以诱导小鼠产生对Kα1T的抗体，还可以诱导小鼠产生对Col-V的抗体，表明在小鼠LTx CR模型中，在BOS形成之前出现了免疫应答扩散。然而，由于HLA分子和肺相关SAgs在不同的染色体上由不同基因编码，所以导致其扩散的机制尚不清楚[6]。
2.2、 外泌体-miRNAs
miRNA可作为新的诊断生物标志物来识别有BOS发展风险的患者。miRNA是器官移植领域的研究热点，它们与靶mRNA结合调控基因表达，这些基因是先天和适应性免疫应答的关键要素。DSA可以诱导生成miRNA，已知的外泌体包含的miRNA，可诱导炎症、内皮激活、Th17分化和抗体介导的排斥反应等，从而触发免疫应答。Xu等[19]研究表明，与稳定性LTxRs血清样本相比，在BOS 12个月时，miR-134、miR-10a、miR-195和miR-133b的表达水平显着下调，miR-144、miR-142-5p和miR-155表达显着上调。还有TGF-β相关miR-NA，即miR-369-5p和miR-144，它们在TGF-β信号通路介导的纤维化中发挥作用。根据上述miRNA可以区分有BOS发展风险的LTxRs。
带有肺相关SAgs的循环外泌体可以预测LTxRs发生CLAD的风险，提示临床医生在LTx发生不可逆损害之前提前制订预防或干预策略。在人类肾脏和心脏移植后CR发生之前，也检测到带有组织相关SAgs的循环外泌体[13]。Vallabhajosyula等[20]对人类胰岛和肾移植受者进行5年随访，分析循环外泌体，发现带有组织特异性SAgs的外泌体长期存在。因此认为，具有组织特异性SAgs的循环外泌体有望成为一种无创性生物标志物，可以监测实体器官移植受者发生排斥反应的风险，为临床移植提供巨大帮助。
3 、外泌体在LTx排斥反应中的作用
Sureshbabu等[9]在小鼠支气管内给予MHC抗体，诱导呼吸道阻塞疾病(OAD)，类似于人类CLAD，重要的是，在OAD临床诊断前检测到了对于外泌体上肺相关SAgs(Col-V,Kα1T)的抗体，证明外泌体可激活免疫应答，导致产生对肺SAgs的抗体并最终导致OAD的发生。供者白细胞的清除，或无法迁移到受者淋巴组织，表明供者移植物来源的外泌体在同种异体抗原识别途径中发挥重要作用。有研究显示，直接识别、间接识别和半直接识别途径在同种异体移植排斥中发挥作用。
3.1 、直接识别和间接识别
在同种异体LTx中，使T细胞活化的主要方式有两种:直接识别[供肺抗原提呈细胞(APC)刺激受者T细胞]和间接识别(受者APC刺激受者T细胞)。直接识别的基本过程是:供肺中的过客白细胞，包括APC和淋巴细胞，移植物血管与受者血管接通后，过客白细胞可进入受者血液循环或局部引流淋巴组织，受者T细胞也可进入移植物中，供者APC将其表面的抗原肽-MHC分子复合物(p MHC)直接提呈给受者的同种反应性T细胞，供其识别，引发移植排斥反应[21]。而间接识别是指供肺的MHC分子经受者APC加工和处理后，以供者抗原肽―受者MHC分子复合物的形式提呈给受者T细胞，使之活化[4]。间接识别是发生移植排斥反应的重要机制，这种排斥反应主要由CD4+T细胞和同种异体反应性抗体产生，BOS与非BOS患者相比，间接识别引起的同种异体排斥反应的频率更高[22]。在AR早期，直接识别机制起主要作用;在AR中晚期和CR中，间接识别机制起更重要的作用[4]。
3.2 、半直接识别
LTx后，受者血液循环和淋巴组织内的APC可以通过各种方式摄取供者抗原，包括吞噬作用、内吞作用或胞饮作用，并以外泌体(同种异体抗原)的形式分泌。由APC分泌的外泌体表面高度富集抗原肽-MHC分子复合物，提示它们可以作为抗原提呈囊泡(APVs)，类似于APC来提呈抗原，从而参与免疫应答[3,6]。有研究表明，外泌体以吞噬体的形式内化和分泌抗原，比DC提呈抗原肽的效率高103～104倍。外泌体维持起源APC的拓扑结构，在囊泡表面暴露MHCⅠ类或MHCⅡ类分子的胞外结构域，可能具有直接刺激CD8+或CD4+T细胞的能力。虽然游离外泌体直接刺激同种异体反应性T细胞的能力有限，但它们携带的p-MHC分子复合物，在APC通过吞噬或微胞饮作用内化时，可作为肽源间接启动T细胞[22]。
树突状细胞(DC)是一种重要的专职性APC，可以提呈抗原，参与免疫调节，介导炎症反应等。在原代DC和DC细胞系中已经观察到由DC分泌的外泌体，并已成为外泌体介导的同种异体识别领域的研究重点[21]。成熟DC释放的外泌体富集MHC分子、黏附分子和共刺激分子，能够触发免疫应答，未成熟DC (im DC)释放的外泌体显示出低水平的MHCⅡ/I类分子以及黏附分子和共刺激分子，具有调节功能，抑制免疫反应[23]。尽管一些研究已经证明了供者DC的重要性，但许多研究小组报道，某些同种异体移植发生AR第一周内，在受者血液循环或移植物引流淋巴组织中无法检测到供者来源的DC，这表明在AR早期，除了直接识别途径以外，可能存在其他机制，移植物来源的外泌体可能在同种异体抗原识别中发挥作用。
存在另一种称为半直接识别的途径，受者T细胞通过供者来源的外泌体被激活[3]。LTx后，受者血液循环或移植物引流淋巴组织中除了过客白细胞，供肺还会释放外泌体，携带供者MHC分子的外泌体被受者APC摄取，受者APC与供者来源外泌体上的MHC分子结合，可以直接或间接地提呈供者MHC分子和其他相关抗原，这一现象被称为异装[24]。Lombardi等[25]证明了受者来源的DC与供者MHC分子异装可以激活受者反应性T细胞，为移植中同种异体T细胞识别的半直接途径奠定了基础。随后，在实体器官和同种异体骨髓移植中，供者MHC分子在受者APC上的存在也被证实。
有研究[26,27,28]也提到，外泌体参与了半直接识别途径，同种异体皮肤、心脏移植后，移植物引流淋巴组织中，受者来源的DC和B细胞被供者来源的携带完整供者MHC分子的外泌体异穿;在心脏或胰岛移植模型中，异装细胞在刺激受者T细胞反应中起有效作用。然而，需要注意的是，外泌体不是被受者DC内化，而是小簇地黏附在受者DC表面，保留完整和功能良好的供者MHC分子和APC激活信号[22]。外泌体通过配体与受体特异性结合的方式与细胞相互作用，与靶细胞胞膜融合，并将其内含物“注射”到靶细胞的胞质中，外泌体中的miRNA调节靶细胞mRNA[5]。
Sharma等[29]提到带有供者H-2分子的循环外泌体具有高水平的热休克蛋白(HSPs)和miR-155，它们可以激活受者DC，受者DC比供者过客DC的数量多。当完整的供者H-2分子从供者转移到受者DC，然后由受者DC提呈给T细胞时，就会发生半直接识别，这种机制使得直接和间接激活的T细胞通过相同的APC进行交叉调节。异装的受者DC通过供者来源的外泌体提供供者H-2分子，通过半直接途径有效激活异源反应性T细胞。
3.3 、外泌体-miRNAs在LTx排斥反应中的调控作用
DSA可以诱导生成miRNA,miRNA不仅有助于合成抗体，还参与纤维蛋白的形成。外泌体包含已知的功能性miRNA,miR-182可诱导炎症、miR-92a参与内皮激活、miR-142-5p参与抗体介导的排斥反应和miR-155促进Th-17分化、T细胞激活等等[30]。
miR-144已被证实参与了BOS的发展。与非BOS患者相比，BOS患者miR-144表达显着增加。miR-144过表达导致TGIF1 TGF-β诱导因子同位序列1 (smads的辅助抑制因子)显着下降，Smad2、Smad4、TGF-β、成纤维细胞生长因子6和血管内皮生长因子表达增加，α-平滑肌肌动蛋白和纤维粘连蛋白水平增加，促进了肺纤维化[4]。miR-155是与炎症相关的miRNA，在多个细胞系中有效上调Toll样受体，是炎症细胞因子(例如IL-17)产生的正调控因子，已被证明在LTx后CR的发展中发挥重要作用[31]。IL-17在BOS发病机制中也起着重要作用:通过多克隆抗IL-17，阻断IL-17可显着减少BOS病变[4]。miR-155在抗MHC诱导的OAD的发病机制中起着不可或缺的作用。研究[32]表明，给予MHCⅠ类抗体后，野生型小鼠肺血管和细支气管周围炎症细胞浸润，纤维化程度增加，管腔闭塞。而敲除miR-155基因的小鼠未表现出明显病变。
阻断来自供肺的外泌体释放有可能防止同种异体移植排斥反应。在结核分枝杆菌感染的小鼠模型中，发现敲除了Rab27a基因的小鼠由于释放外泌体的能力减弱，刺激T细胞的效率较低。有一些小的抑制分子如中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869，酸性鞘磷脂酶抑制剂盐酸丙咪嗪，可以有效地阻断来自各种组织和细胞的外泌体诱导。但一项研究表明，虽然GW4869降低了外泌体的分泌，但它增强了更多的浆膜来源EV的分泌;Rab27a在减少外泌体分泌的同时，也可以减少一些非EV结合的可溶性因子的分泌，表明这些抑制方法可能会间接影响EV的组成和分泌，改变细胞功能[5]。同时在机体正常生理过程中，外泌体可以实现细胞间的通信，维持内环境稳定。因此我们应该只阻断移植器官释放外泌体，不要影响其他组织或细胞外泌体的释放。在体外肺灌注过程中阻断供肺的外泌体诱导，能够减少肺损伤，改善移植器官的功能，这样即使是边缘肺也可以成功移植。Ravichandran等[5]提到在体外肺灌注过程中阻断外泌体的形成和释放是可行的。
外泌体介导AR和CR的机制尚不十分清楚，进一步深入研究这些机制对理解LTx后免疫过程的发展至关重要，并将为未来的治疗和生物标志物的发现提供方向。
4 、外泌体作为治疗策略
研究[21]证明，EVs在妊娠期间孕妇对胎儿同种异体抗原的耐受以及实验室啮齿动物对同种异体肝移植耐受相关的免疫特权中发挥重要作用。在肠道、心脏、肝脏或肾脏移植模型中，外泌体与低剂量免疫抑制剂或供者特异性Treg联合可以有效提升同种异体移植物的存活率[3]。利用外泌体治疗替代免疫抑制治疗，可能为处理移植后的严重副作用，提高异体移植存活率开辟新的前景。
外泌体也是靶向药物递送的有效候选物，在药物传递方面，外泌体与脂质体等传统合成材料相比具有各种优势。外泌体介导的药物传递的治疗潜力仍在初步临床试验中(胰腺癌、急性缺血性脑卒中和结肠癌)[33]。近年来，为了克服天然外泌体的局限性，基于纳米生物技术的人工外泌体不断涌现，低免疫原性和毒性的人工外泌体可以有效运输药物、蛋白质和核酸等物质，外泌体的脂质双层膜结构可以作为内容物的天然保护屏障，防止周围酶类对运载物的分解，在LTx领域中将会起到重要作用[3]。纳米生物技术的进步有利于开发人工外泌体，这可能会加速外泌体在移植领域的临床转化，人工外泌体因其大规模生产而具有商业优势。未来，依靠生物技术、纳米技术、化学工程和制药行业等多学科的努力，将开发出新颖、多功能的人工外泌体，以改善医疗保健。我们对外泌体在LTx治疗方面的潜力充满信心。
5 、小结
外泌体是一种重要的生物标志物，用于识别可能发生CLAD风险的LTxRs。相关研究还需要揭示来自移植器官的外泌体生物发生的新机制，以及外泌体在人LTx后CLAD发展中的不同作用，外泌体介导的同种异体识别可能为解决移植领域的新问题提供了缺失的一环。外泌体正在成为药物输送的有效纳米载体，对靶细胞进行药物传递，有望在移植领域成为一种极具开发潜力的运输载体。
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