肝素抗凝血浆对钒酸盐氧化法测定总胆红素的影响

张伟雯杨凤啸：广州医科大学附属第三医院广东广州510150

【摘要】目的

探讨肝素抗凝血浆对钒酸盐氧化法测定总胆红素（Total Bilirubin，TB）结果的影响。方法采用钒酸盐氧化法平行测定300例患者的血清和肝素抗凝血浆标本中TB含量，并对两种方法的检测结果进行分析和比较。结果肝素抗凝血浆致钒酸盐氧化法测定TB结果降低。TB含量在1?7~300 μmol/L范围内，肝素抗凝血浆的TB检测结果普遍低于血清2~45 μmol/L；随着TB浓度的升高，检测结果的偏差越大；血清TB值y对于肝素抗凝血浆TB值?x?的校正公式为：?y?=1?197 4?x?+2?204 7；线性试验和方法比较试验均显示两者具有良好的相关性。结论肝素抗凝血浆致钒酸盐氧化法测定TB结果降低。

【关键词】肝素钒酸盐氧化法总胆红素

【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence of heparin on the total bilirubin level detected by vanadate oxidation method.

MethodsVanadate oxidation method was applied to detect total bilirubin in a range of 300 heparin anticoagulant plasma and serum samples.

ResultsHeparin made low resalt in the detection of vanadate oxidation method; the total bilirubin in heparin anticoagulant plasma was lower than serum.

ConclusionIn order to ensure the accurate and risible result; the serum samples should be adopted instead of heparin anticoagulant plasma samples.

【Key words】Heparin, Vanadate Oxidation Method, Total Bilirubin

【Author′s address】The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong Probince 510150 PRC?

doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2014.06.030

胆红素是老化的红细胞中血红蛋白经过单核-吞噬细胞系统处理后的代谢产物，血液中胆红素的改变能反映出机体中某些脏器（如肝脏、胆囊、肾脏等）的功能状况??［1］?。其准确有效的测定有助于判断黄疸的程序和类型。长期以来，人们一直在寻找测定胆红素行之有效又适合临床需求的方法，而钒酸盐氧化法测定胆红素的诞生，恰恰解决了这方面的需求，因此，钒酸盐氧化法也成为目前各临床实验室测定胆红素中应用较为普遍的方法之一。由于钒酸盐氧化法使用的反应起动剂（钒酸盐）本身呈浅黄绿色，在450 nm处有一定的吸光度（A值），反应启动后的读点比实际值略高，从而使反应前后的△A值减小，这种差异在A值变化较小的低值总胆红素（Total Bilirubin，TB）的检测中易于体现出来。在临床生化检测工作中，血清的分离需要20~30 min，若对一些急诊项目的检测尝试以肝素抗凝血浆取代血清，可以减少等待血清分离的时间，实现结果的快速报告??［2］?。但在测定过程中我们发现，用肝素抗凝血浆代替血清测定TB时（钒酸盐氧化法），其测定结果往往偏低。为进一步解释此现象，笔者收集300份来本院就诊的患者的血清和肝素抗凝血浆标本进行TB的测定，分析比较两者之间的差别，以评价肝素抗凝血浆是否满足于临床实验室的检测需求。?

1材料与方法?

1.1仪器?

日立Hitachi 7170全自动生化分析仪。?

1.2检测试剂与器材?

利德曼生化股份有限公司生产的总胆红素测定试剂盒-TBIL（钒酸盐氧化法；Lot：305062D）。主要组成成分R1：柠檬酸缓冲液（100 mM），反应促进剂（1 mmol/L），表面活性剂（2 mmol/L）；R2：磷酸缓冲液（10 mM），偏钒酸钠（4 mmol/L）。阳普医疗科技股份有限公司生产的普通真空管和肝素抗凝管。?

1.3检测原理?

在pH 3?0附近，表面活性剂和钒酸作用于胆红素，使之氧化成胆绿素，而此时胆红素所持有的黄色减少，由此测定钒酸盐氧化前后450 nm处吸光度差值求出样本中胆红素浓度??［3］?。

1.4方法?

1.4.1标本采集选择300例来我院就诊的患者，采用真空采血针按常规方法采集两管静脉血：一管为普通真空管，离心分离血清；另一管为肝素抗凝管，离心分离血浆。2 h内完成检测。另以每100 μl同一患者的血清和肝素抗凝血浆标本分装，置于-20 ℃冰冻避光保存。?

1.4.2实验操作采用同一仪器，同一试剂，同一方法，同一操作人员，尽可能做到其它条件一致。分别对300份血清和肝素抗凝血浆标本平行测定其TB含量，并将结果记录下来，进行对比分析。?

1.4.3线性试验取无明显脂血溶血的高TB病人血清和肝素抗凝血浆标本各一例，用钒酸盐氧化法测得血清TB=335?1 μmol/L，血浆TB=286?4 μmol/L。对两例标本用生理盐水进行2、4、8、16、32、64倍稀释，共计取得7个不同浓度水平的标本，按随机次序对每份标本重复测定4次，并将结果记录下来。将测得值进行线性回归分析和相关性分析。?

1.5统计学处理?

采用spss 19?0软件进行数据统计分析。计数资料数据采用均数±标准差（±s?）表示，采用配对?t?检验，?p?<0?05表示有显著性差异。?

2结果?

2.1300份血清与肝素抗凝血浆TB检测结果比较?

TB含量在1?7~300 μmol/L范围内，肝素抗凝血浆TB检测结果普遍低于血清TB检测结果2~45 μmol/L。结果见表1。

2.2血清与肝素抗凝血浆TB检测结果之间的差值?

随着总胆红素浓度的升高，肝素抗凝血浆的总胆红素值与血清总胆红素值的偏差越大，肝素对钒酸盐氧化法的干扰越严重。见图1。

2.3线性试验?

钒酸盐氧化法测定血清和肝素抗凝血浆TB的线性回归方程分别为?y?=1?006 2?x?-0?017 6和?Y?=1?003 2?X?~0?155 8，相关系数分别为?r?=1和?R?=0?999 9。见图2。

2.4血清与肝素抗凝血浆TB测定值校正公式?

血清TB测定值?y?对于肝素抗凝血浆TB测定值?x?的校正公式为：?y?=1?197 4?x?+2?204 7。见图3。

3讨论?

正常人血液中的胆红素绝大部分是衰老的红细胞在单核-巨噬细胞系统中受到破坏而产生出来的血红蛋白逐步衍化而成，另有10%～20%的胆红素是由肌红蛋白及游离血红素等在肝内合成。当胆红素生成过多、肝细胞摄取、结合、转化及排泄等功能发生障碍或胆道堵塞时，均可引起血中总胆红素和直接胆红素的增多，出现黄疸等症状。目前，国内外学者先后摸索并成功地推出了许多测定血清总胆红素的方法，主要有重氮反应法、改良J-G法、胆红素氧化酶法、钒酸盐氧化法、亚硝酸钠氧化法??［4］?。而对于血浆标本的检测是否同样符合实际工作需求，目前看法仍不统一。1993年由日本学者TOKUDA建立的钒酸盐氧化法测定血清总（直接）胆红素，是目前实验室应用较为普遍的方法之一??［5］?。我们将此方法应用于测定肝素抗凝血浆中总胆红素含量，发现肝素抗凝血浆中TB值普遍低于血清TB值。由于钒酸盐氧化法测定总胆红素的原理是在pH 3.0附近，表面活性剂和钒酸作用于胆红素，使之氧化成胆绿素，而此时胆红素所持有的黄色减少，由此测定钒酸盐氧化前后450 nm处吸光度差值求出样本中胆红素浓度；而在总胆红素检测试剂盒中，R1含有一种带NH?+?4的表面活性剂，而肝素为含有长短不一的直链阴离子的粘多糖，带有大量负电荷，呈现强酸性，可与带有NH?+?4的呈强碱性的表面活性剂发生化学反应，形成不溶性的白色混悬液，在450 nm处使吸光度升高，致使反应前后的△A值减小，从而使总胆红素的计算结果降低??［6-7］?。因此，在对血浆总胆红素进行测定时，其测定结果应经过校正公式??y?=?1?197 4?x? +2?204 7转换为血清总胆红素值方可报告临床。本研究还发现，同时用生理盐水分别对血清高值胆红素〖CM(81mm〗及肝素抗凝血浆高值胆红素作不同倍数稀释测定，其结果无显著性差异,与程涌江等??［8］?报道有差异。?

新生儿黄疸是常见的新生儿疾病之一，其出生后72小时内需严密监测皮肤黄染情况，常规检测包括血总胆红素测定??［9］?。所以，总胆红素的准确测定涉及到对新生儿黄疸患者的诊断、治疗、监测??［10］?。另肝胆疾病、黄疸的鉴别诊断也需要准确的总胆红素的测定。临床上的判断数据以血清检测值作为标准。通过以上的检测数据，可见利用钒酸盐氧化法测定血清和血浆总胆红素差异较大，两者间若无有效的转换标准，会对临床判断造成干扰。?

综上所述，肝素抗凝剂可致钒酸盐氧化法测定TB结果降低。在测定血液中TB含量时，为确保TB结果的准确可靠，应尽量采用血清标本，而不应采用肝素抗凝血浆标本??［11-12］?。若结果为血浆TB测定值，则必须经校正公式?y?=1?197 4?x?+2?204 7转换为血清TB值后方可报告临床。?

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