宋祖荣
（安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088）
摘 要：目的：探析益气活血方对早期糖尿病肾病大鼠肾脏PKC、TGF-β1及血清Chol、TG等指标的影响.方法：选择糖尿病肾病造模成功的64只SD大鼠，随机分为空白对照组（11只）、依那普利组11只、益气活血方大剂量组（观察组1，14只）、益气活血方中剂量组（观察组2，14只）、益气活血方小剂量组（观察组3，14只），并选择11只健康SD大鼠作为正常组.比较与分析各组大鼠的血清TG、Chol水平以及大鼠肾组织PKC、TGF-β1指标表达情况.结果：DN空白对照组大鼠的血清TG、Chol水平、肾组织PKC、TGF-β1表达均明显高于正常组、依那普利组以及益气活血方组.其中，益气活血方组的三个剂量组均可显著降低血清TG、Chol水平、肾组织PKC、TGF-β1表达等，尤以大剂量组的效果最优.结论：益气活血方可以有效缓解肾小球纤维化病变，从而有效保护肾脏.
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关键词 ：益气活血方；糖尿病肾病；SD大鼠
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-260X（2015）04-0071-03
基金项目：在研项目：《两中医治法对脑缺血大鼠神经干细胞Wnt/β-catenin通路影响及作用机制研究》（安徽省教育厅自然研究重点项目：No.KJ2014A098）
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最为严重的并发症之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一.在现代医学中，糖尿病的病因及发病机制还不是完全清楚，但主要涉及到遗传、代谢、自身免疫等方面，是多种致病因素共同所致；因此，目前缺乏病因的有效治疗方法，缺乏针对性的防治药物.通过相关研究表明[1]，蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）与转化生长因子－β1（TGF-β1）与早期DN的发生有着十分密切的联系.在祖国医学中糖尿病被称为消渴病，而益气活血法是临床上治疗糖尿病的常用中医治法.本实验主要研究观察益气活血方对早期DA大鼠模型血清中甘油三脂（Triglyceride，TG）、胆固醇（cholesterol，Chol）水平变化的影响，同时观察对肾脏组织中PKC、TGF-β1的表达，探讨益气活血方对早期DA的影响及其作用机制.
1 材料
1.1 实验动物
健康SD雄性大鼠80只，体重200g~240g，由南京医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（苏）2002-0031.
1.2 药物与试剂
益气活血方（脑络欣通）：黄芪30g、三七10g、川芎10g、红花6g等，由安徽中医药大学中药制剂室制备；Z20071185）；依那普利（杭州赛诺菲民生制药有限公司，批准文号：J20030113）；链脲佐菌素（Streptozin，STZ，美国Sigma公司）；TGF-β1（兔多抗，上海科兴商贸有限公司）；PKC（兔多抗，上海丽臣商贸有限公司）；PKC试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）.
1.3 仪器
ASP200组织脱水机（德国Leica公司），TB-718生物组织自动包埋机（湖北孝感泰维电子设备有限公司），LKB超薄切片机（日本太阳株式会社产品），TR-180II型生物组织全自动染色机（湖北泰维科技实业有限公司）TK-218I恒温摊片拷片机（湖北孝感泰维电子设备有限公司），Olympas BX-53光学显微镜（日本奥林巴斯光学株式会社产品），DP801形态学显微图像分析系统（江苏南京捷达科技发展有限公司）.
2 方法
2.1 DN模型大鼠复制方法
SD雄性大鼠，用普通饲适应性喂养1周后，用试纸法检测尿糖、尿蛋白阴性后，随机抽取11只作为正常组；其余69只大鼠作为造模组，按文献方法行左侧肾脏切除术+STZ复制DN模型[2].造模前禁食12h，造模成功后一周，造模组按30mg/kg剂量腹腔内注射STZ，正常组腹腔内注射等量柠檬酸缓冲液.72h后经大鼠尾静脉采血测血糖，空腹血糖（FBG）≥16.7mmol/L，而且出现多饮、多食、多尿等临床表现，可以确认为糖尿病模型.在连续喂养8周后，测24h尿蛋白定量≥20mg，为DN造模成功.在造模过程中死亡5只，造模成功64只.
2.2 分组及给药
将造模成功的64只大鼠随机分为空白对照组（11只）、依那普利组11只（1.04mg/kg/d）；益气活血方大剂量组（观察组1，14只）21.8g/kg/d；益气活血方中剂量组（观察组2，14只）10.9g/kg/d；益气活血方小剂量组（观察组3，14只）5.45g/kg/d.正常组、空白对照组同样方法予以等量的生理盐水灌胃，每天给药1次，各组连续给药12W.
2.3 取材及指标的测定
于末次给药后，禁食不禁饮12h，用10%水合氯醛麻醉（3.6mL/kg BW，ip）大鼠，取仰卧位，行胸腹联合正中切口，充分暴露心脏及右肾，各组于心脏采血，肝素抗凝，测定血清TG、Chol；然后，摘取右肾，剥离肾包膜，称重，切取肾组织，置
于100ml的10％中性甲醛溶液中固定48h后，脱水、透明、浸蜡、包埋后，采用免疫组化法测定肾脏组织中PKC、TGF-β1表达.
2.4 统计方法
所得数据均采用IBM spss Statistics20.0软件进行统计分析，计量资料数据用均值±标准差（x±s）表示，进行单因素方差分析，两两比较用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义.
3 结果
3.1 各组大鼠的血清中TG、Chol水平的比较
DN空白对照组大鼠的血清TG和Chol水平均明显高于正常组、依那普利组以及益气活血方组.其中，益气活血方组的三个剂量组均可显著降低血清TG和Chol水平，尤以大剂量组的效果最优，详见表1.
3.2 各组大鼠肾组织PKC、TGF-β1指标表达情况比较
DN空白对照组大鼠的肾组织PKC、TGF-β1表达均明显高于正常组、依那普利组以及益气活血方组.其中，益气活血方组的三个剂量组均可显著降低PKC、TGF-β1表达，尤以大剂量组的效果最优，详见表2.
4 讨论
糖尿病属于内分泌-代谢性疾病，是以高血糖为特征的病变，是危害人类健康的重大疾病之一；其发展会引起糖尿病肾病等合并症，通过相关的实验研究发现[3]，在糖尿病早期血清中的TG、Chol等即已升高，且随着肾脏损害的加重，血脂紊乱更加严重.同时近年来，随着对细胞内信息转导与细胞功能调节对糖尿病并发症作用的深入研究，人们发现二脂酰甘油（Diacylglycerol，DAG）-蛋白激酶C（PKC）信号转导通路的激活及TGF-β1的高表达与早期DN的发生密切相关.而PKC广泛存在于机体的组织细胞内，主要以非活性形式存在于细胞浆中，以活性形式结合于细胞膜，是细胞内重要的信息转导系统.PKC活化在DN的发生过程中起关键性作用[4，5]，PKC活化后，首先诱导有丝裂原活化蛋白激酶（MEK），再进一步活化细胞外信号调节激酶（ERK），ERK被激活后转位至细胞核诱导TGF-β基因表达[6].TGF-β的分布有一定的组织特异性，肾脏以TGF-β1为主，TGF-β1能够促进系膜细胞摄取葡萄糖，同时葡萄糖又可以增加TGF-β1表达，从而形成了恶性循环，不断地加重了DN病变过程[7，8].
益气活血法是治疗DN常用治法[9].在祖国医学中，DN多属于“消渴”的范畴，古代医家一般认为，消渴病的发生多与饮食不节，情志失调，先天禀赋不足等因素有关；但其根本病因是由于病变日久导致肾气亏虚而成，而气虚无力行血，致血行不畅而成瘀.因此，DN的病机主要与气虚血瘀有关[10]，而痰饮、水湿等亦可导致血瘀的发生.因而作为益气活血法的代表方脑络欣通，可以通过益气以助血行，活血以畅通气血；而气行则水行，气盛则可推动津液在体内的运行，防治痰饮、水湿在体内的停聚，进而防止淤血的产生.
本实验研究发现，经过STZ复制DN模型大鼠血清中Chol、TG水平显著高于正常组，同时肾组织PKC、TGF-β1表达也增强；而与正常组比较，益气活血方各组大鼠血清中Chol、TG水平显著降低，同时PKC、TGF-β1表达也显著降低，尤其是大剂量组明显优于中剂量组和小剂量组.因此本研究表明，益气活血方可以通过抑制PKC、TGF-β1的活化，减少系膜细胞摄取葡萄糖，进而，减少肾小球系膜外基质增生，有效的延缓肾小球纤维化的进程，从而达到保护肾脏的功效；同时益气活血方可以通过降低血清中Chol、TG水平，来调节脂质的代谢，从而延缓早期DN病程的进一步发展.
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参考文献：
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（7）王郁金，苏衍进，马居里，等，益气活血方对早期 DN大鼠肾脏PKC、TGF-β1及血清Chol、TG的影响[J].现代中医药，2014，34（1）：78-79.
（8）李阳.糖尿病肾病的发病机制及治疗进展[J].当代医学，2010，16（26）：18-20.
（9）王郁金，苏衍进，马居里，等.自拟益气活血方对早期糖尿病肾病大鼠肾脏PKC AGEs及TGF-β1表达的实验研究[J].四川中医，2014，32（4）：68-69.
（10）正华，范丽，应小平，等.通络益肾汤对DN模型大鼠肾组织转化生长因子-β1的影响[J]．陕西中医学院学报，2010，33（3）：58-61.