莫坚莫桂熙刘亦君：广东医学院附属医院广东湛江524001
李晓芸沈宁：中山大学附属第三医院广东广州510630
【摘要】目的
观察缺血前使用肥大细胞脱颗粒剂［Compound 48/80（CP）］对小肠缺血-再灌注损伤的影响及机制。方法健康清洁级雄性昆明小鼠，随机分为三组：假手术组、缺血-再灌注组及CP缺血前处理组。在缺血前15 min分别静脉注射CP 1 mg/kg（CP缺血前处理组）或等量生理盐水（假手术组及缺血-再灌注组）后，缺血-再灌注组与CP缺血前处理组建立小肠缺血30 min再灌注损伤模型，观察再灌注3天内动物存活率的变化；并评价再灌注3 h小肠病理损伤变化及检测肥大细胞蛋白激酶4（MCP-4）、血浆内皮素-1（ET-1）、肿瘤坏死因子（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）浓度与类胰蛋白酶蛋白表达及过氧化物酶(MPO)活性。结果缺血-再灌注组的生存率较假手术组明显降低（?p?<0?05）； CP缺血前处理组生存率明显高于缺血-再灌注组（?p?<0?05）。与假手术组比较，缺血-再灌注组小肠损伤评分、 ET-1、TNF-α及IL-6浓度及MPO活性显著升高（?p?<0?05）；缺血-再灌注组类胰蛋白酶与MCP-4表达较假手术组明显升高（?p?<0?05）。与缺血-再灌注组比较，CP缺血前处理组上述指标显著降低（?p?<0?05）；而MCP-4表达进一步升高（与缺血-再灌注组比较，?p?<0?05）。结论缺血前应用肥大细胞脱颗粒剂能够减轻小肠缺血-再灌注损伤，可能与肥大细胞释放MCP-4有关。
【关键词】肥大细胞生存率肿瘤坏死因子肥大细胞蛋白激酶-4
【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective role of mast cell degranulation prior to ischemia in small intestinal ischemia reperfusion injury(IIRI) in mice.
MethodsAdult Kunming mice were randomized into sham operated group(SH group), sole IIR group(M group) in which mice were subjected to 30 min superior mesenteric artery occlusion followed by 3 hours or 3 days reperfusion, or IIR being respectively intravenously injected with Compound 48/80(1 mg·kg??-1?) 15 minutes prior to ischemia(PreCP group). Survival rates during 3 days were observed, and at the 3 h after reperfusion, the small intestine was obtained for histologic injury assessment, protein expressions of tryptase and mast cell protease 4(MCP-4) in small intestine were measured, levels of ET-1, TNF-α, and IL-6 and MPO activity in the intestine were measured.
ResultsIIR resulted in small intestine injury manifested as significant increases in mortality as well as intestine histological scores(?p?<0?05), accompanied with concomitant increases of tryptase and MCP-4 protein expressions and elevations in ?ET-1?, TNF-α and IL-6 concentrations and MPO activity in small intestine as compared with SH group(?p?<0?05). Administration with Compound 48/80 15 min prior to ischemia markedly reduced the above biochemical changes(?p?<0?05 vs M), moreover, MCP-4 expression was significant higher in PreCP group than that in M group(?p?<0?05).
ConclusionMast cell degranulation prior to ischemia contributes to better therapeutic benefits in attenuating IIR injury in mice possibly by releasing MCP-4.
【Key words】Mast cell， Surviva， TNF-α， MCP-4
【Author′s address】The affiliated hospital of GuangDong Medical University, ZhanJiang， Guangdong 524001 PRC
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2014.06.009
肥大细胞广泛分布在胃肠道黏膜中，胞内含有大量的颗粒物质，在这些介质中，其中类胰蛋白酶、组胺参与小肠缺血-再灌注损伤进程??［1］?；另一方面，肥大细胞激活释放羧肽酶A3明显减轻ET-1〖JP〗及内毒素的毒性??［2］?；PILIPONSKY AM发现肥大细胞蛋白激酶4（MCP-4，糜蛋白酶）可降解TNF-α??［3］?；BOROS M在小肠缺血前使用肥大细胞脱颗粒剂Compound 48/80（CP）明显减轻犬小肠缺血-再灌注损伤，但其具体机制尚不明确??［4］?。因此，本研究拟进一步探讨缺血前激活肥大细胞释放保护性介质在小肠缺血-再灌注损伤中的作用及其具体作用机制。?
1材料与方法?
1.1实验动物分组及模型制作?
经中山大学动物伦理委员会批准，健康清洁级昆明小鼠（广东省实验动物中心提供，合格证号：0063740），体重20～24 g，雄性。随机分为三组：假手术组（SH组）、小肠缺血-再灌注组（M组）、及小肠缺血前CP处理组（PreCP组）。所有动物均于术前16 h禁食，自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛0?01 ml·g??-1?麻醉后，仰卧位固定，腹部脱毛，消毒铺巾后，沿腹部正中切口进腹，分离肠系膜上动脉。用无损伤动脉夹夹闭肠系膜上动脉，30 min后移开动脉夹进行再灌注。模型复制成功的标准为缺血处肠系膜微动脉搏动消失；再灌注前肠道淤黑、肿胀；动脉夹松开后缺血处肠系膜微动脉恢复搏动。SH组只分离肠系膜上动脉，而不进行阻断。PreCP组在缺血前15 min经尾静脉注射CP（Sigma， 1 mg/kg），注射药物的容积为5 μl/g；而SH组及M组在静脉注射相同体积的生理盐水。在再灌注时刻，缝合腹膜、肌肉和皮肤，腹腔内注射5％头孢哌酮注射液（50 mg/kg）预防伤口感染，并皮下注射37 ℃生理盐水0?033 ml/g预防手术操作导致的水分丢失。
1.2观察指标与标本的采集及检测?
1.2.1动物生存率手术操作完成后，用3％苦味酸将各组动物进行标记，并用金属网笼进行饲养（4~5只/笼），同时给予标准饲料饲养，自由饮水，连续观察各组动物在再灌注3天内的存活率，每组含20只小鼠。?
1.2.2小肠病理损伤评价在再灌注后3 h时麻醉被处死后，取小肠（距回肠末端5 cm）标本，用10％的甲醛固定，石蜡切片，苏木精－伊红（HE）染色，光镜下观察小肠粘膜病理变化，小肠粘膜病理变化采用Chiu′s评分法??［5］?。正常为0分，绒毛顶端上皮下间隙增宽为1分，绒毛顶端上皮下间隙进一步扩大，绒毛尖端上皮抬高与固有膜剥离为2分，绒毛上皮成块脱落为3分，上皮完全脱落，仅有固有膜为4分，固有膜层崩裂，出现出血与溃疡为5分。?
1.2.3MCP-4的表达在再灌注3 h时，取小肠组织，采用Western blotting方法，150 μg的样品加入10％的分离胶和5％的浓缩胶，进行电泳，转PVDF膜室温下用TBST洗膜5 min×3次。加入一抗，大鼠抗MCP-4（1∶250，Santa Cruz提供）及兔抗β-actin（1∶3 000），4 ℃孵育过夜。分别以HRP标记的二抗兔和二抗大鼠（1∶1 000），其中β-actin二抗兔（1∶2 000）室温孵育膜1 h。TBST洗膜10 min×3次，ECL发光试剂盒显影，胶片曝光显影。?
1.2.4类胰蛋白酶表达的检测采用免疫组化SP染色法，石蜡切片脱蜡至水后蒸馏水清洗，用PH 9?0 EDTA高压修复2 min后自然冷却，蒸馏水清洗后， 3%双氧水浸泡10 min后再用蒸馏水清洗，PBS清洗5 min×3次，加一抗 37 ℃水浴1 h，再用PBS 清洗5 min×3次，加二抗在 37 ℃水浴30 min，PBS清洗5 min×3次，1∶1∶1 DAB显色，苏木素复染2 min，0?1%盐酸酒精分化，用水冲洗10 min后用95%酒精脱水；烤箱烤干后中性树胶封片。试剂盒购自迈新生物工程有限公司。以胞浆显棕黄色为阳性细胞，于每张切片中用200倍光镜随机选取5个肠粘膜部位进行观察，采用BI-2000彩色图像分析系统（泰盟）对类胰蛋白酶染色阳性细胞进行分析，并测定积分光密度值（积分光密度值＝阳性平均光密度值×阳性目标总面积），以积分光密度值作为类胰蛋白酶相对表达含量。
1.2.5小肠ET-1、TNF-α及IL-6浓度的检测取上述小肠组织匀浆标本，采用对应的试剂盒，采用ELISA法并按照说明书测定小肠ET-1、TNF-α及IL-6的浓度，最终数值以所测得浓度/总蛋白量表示。?
1.2.6小肠MPO活性检测参照说明书，采用相应的试剂盒（南京建成）测得，最终数值以所测得MPO活性/总蛋白量表示。?
1.3统计学方法?
用spss 12?0软件系统进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(?〖AKx-D〗±s?)表示，组间比较采用单因素方差分析或秩和检验；生存率采用生存分析进行比较，以?p?<0?05表示统计有显著差异。?
2结果?
2.1CP预处理对再灌注3 d生存率的影响?
M组再灌注第3 d的生存率为30%，明显低于SH组（??p?<?0?05）。 PreCP组的生存率尽管显著高于模型组（?p?<0?05）；但仍低于假手术组（?p?<0?05）,见图1。
2.2CP预处理对再灌注3 h时肠道病理损伤的影响?
SH组粘膜上皮细胞结构完整，排列整齐；M组表现为上皮下间隙的扩大，绒毛上皮和固有层的中度分离，部分绒毛顶端上皮层的破损及绒毛顶端出血，Chiu′s评分明显高于SH组（?p?<0?05）；PreCP组粘膜上皮细胞结构基本完整，排列基本整齐，有少量出血及炎症细胞浸润，Chiu′s评分明显低于M组（?p?<0?05），并显著高于SH组（?p?<0?05,见表1,图2。?
2.3CP预处理对类胰蛋白酶表达的影响?
M组及PreCP组类胰蛋白酶分别较SH组明显增高（?p?<0?05）；与M组比较， PreCP组类胰蛋白酶明显降低（?p?<0?05），见图3。?
2.4CP预处理对MCP-4表达的影响?
M组及PreCP组MCP-4表达分别较SH组明显增高（??p?<?0?05）；与M组比较， PreCP组MCP-4表达明显增加（??p?<?0?05）,见图4。
2.5CP预处理对ET-1、TNF-α及IL-6浓度的影响?
〖JP3〗相对于SH组：M组及PreCP组ET-1、TNF-α及IL-6浓度均显著升高（?p?<0?05）。PreCP组ET-1、〖JP〗TNF-α及IL-6浓度均较M组明显降低（?p?<0?05）,见表1。?
2.6CP预处理对小肠MPO活性的影响?
与SH组比较：M组及PreCP组MPO活性显著升高（?p?<0?05）。和M组比较：PreCP组MPO活性明显降低（??p?<?0?05）,见表1。
3讨论?
小肠缺血-再灌注损伤导致的高死亡率及致残率仍是困扰临床的危重症之一。我们和其他学者分别证实小肠缺血后肥大细胞激活脱颗粒释放组胺、类胰蛋白酶加重小肠缺血/再灌注损伤的进展??［1］?。肥大细胞胞内含有大量的介质，包括组胺、TNF-α、IL-6、类胰蛋白酶、糜蛋白酶及羧肽酶等，这些被释放的介质既具有促进炎性反应作用，同时也具有抗炎性损伤作用，因此如何合理激活肥大细胞以达到减轻小肠缺血-再灌注损伤中的作用目前仍不清楚。?
本研究选择小肠缺血30 min模型，同时根据复合物48/80的作用机制及消除半衰期，在缺血前15 min进行静脉注射，发现在小肠缺血前激活肥大细胞脱颗粒能够明显提高动物的存活率。由于肠道在再灌注3 d内能基本修复正常，而在小肠缺血-再灌注3~6 h内损伤最为严重??［6］?，本研究发现在肠缺血前应用CP能够减轻再灌注3 h小肠损伤；降低炎性因子的浓度。BOROS M分别在缺血前48、24及1 h用 Compound 48/80与Cremophor-El（肥大细胞脱颗粒剂），发现犬肠缺血120 min/再灌注120 min后肠道损伤明显减轻??［4］?；本研究结果与BOROS M报道一致。?
〖HJ〗MCP-4是肥大细胞特异性释放的糜蛋白酶的一种亚型，MCP-4能够降解TNF-α，从而显著减轻因感染性休克导致的死亡率??［3］?；同样，HENDRIX S报道肥大细胞激活释放MCP-4能够缓解创伤后脑损伤炎症反应??［7］?。本研究发现在缺血前肥大细胞激活组其TNF-α浓度明显低于模型组，可能与MCP-4降解TNF-α有关。?
羧肽酶A3是肥大细胞释放的另一种蛋白酶，羧肽酶A3具有降解内毒素及ET-1等引起的毒性作用??［2］?，同时，另有学者AKAHOSHI M发现肥大细胞释放的特异性羧肽酶A3能够减轻因蛇毒导致全身炎性反应，与降解?ET-1?有关??［8］?。本研究推测缺血前应用CP能够减轻小肠缺血-再灌注损伤与其激活肥大细胞释放羧肽酶A3降解ET-1有关，由于本研究并没有测定羧肽酶A3的浓度，需进一步研究阐明其作用原理。?
另外，我们还发现PreCP组类胰蛋白酶的浓度仍高于假手术组，前期研究已证明类胰蛋白酶是加重炎症反应的重要介质，因此肥大细胞激活释放各种介质具有“双重作用”??［9］?，既能保护炎症反应，也能促进炎症反应，这种生物效应提示我们需要针对性对肥大细胞进行处理。?
综上所述，肠缺血前激活肥大细胞脱颗粒能够减轻小肠缺血-再灌注损伤，提高动物的生存率，可能与释放MCP-4有关。?
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