冯 越1 蔡士昌1 蔡朋朋2 李雪松2 孙智睿3 费洪新4 徐广有5
1.齐齐哈尔医学院 2009级学生，黑龙江齐齐哈尔 161000； 2.齐齐哈尔医学院附属三院消化科，黑龙江齐齐哈尔 161000；
3.齐齐哈尔医学院附属三院心内科，黑龙江齐齐哈尔 161000； 4.齐齐哈尔医学院组胚室，黑龙江齐齐哈尔 161000；
5.齐齐哈尔医学院微形态实验室，黑龙江齐齐哈尔 161000
[摘要] 目的 研究三氧化二砷对肠癌细胞HCT116中TGF-β/Smads信号通路的Smads相关基因表达变化，阐述Smads相关基因在肠癌HCT116细胞中的变化规律，探讨肠癌发生的病理机制，和分析As2O3作用新靶点。 方法 实验分空白对照组,低剂量As2O3组，中剂量As2O3组，高剂量As2O3组,在体外培养72 h后取出细胞用于实验。采用免疫荧光化学术和Westernblotting检测Smad3、Smad7蛋白的表达变化。结果 三氧化二砷为0.5~2.5 μmol/L时，Smad3分别为（19.94±1.57），（34.17±1.28），（39.64±1.63）,Smad7分别为（31.53±0.67），（21.69±0.94），（20.04±0.31），与对照组Smad3 （16.61±0.64）,Smad7 3（8.61±0.64）比较，各组差异有统计学意义（P<0.05）； westernblotting 显示三氧化二砷能同时下调Smad7蛋白的表达，上调Smad3蛋白的表达而对肿瘤细胞的生长进行调控。结论 TGF-β/Smads信号通路的Smad3，7在肠癌发生发展起重要的调控作用，三氧化二砷可通过改变Smad3，7表达，而对肠癌细胞HCT116生长进行抑制。
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关键词 三氧化二砷；HCT116；Smad3；Smad7
[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）08（b）－０064-03
大肠癌是消化系统常见的肿瘤，已跃居成为恶性肿瘤死因的第4位[1]。大肠癌的发生发展是多因素、多阶段、多步骤的过程，涉及一系列调控基因和因子的变化，其中TGF-β/Smads信号传导通路是控制细胞增殖和诱导凋亡的重要通路，在肿瘤的发生，发展过程中具有重要的作用。三氧化二砷(As2O3)的抗肿瘤效果已得到多数学者肯定[2-4]，As2O3主要是通过抑制细胞增值，诱导细胞分化和凋亡起到抗肿瘤的目的，三氧化二砷对体外肠癌细胞的作用，国内研究较少，先期研究已经表明As2O3对肠癌HCT116细胞具有明显抑制作用，且随浓度增加而增强，本研究继续将三氧化二砷作用于肠癌HCT116细胞，应用免疫荧光化学术，Western blotting观察TGF-β/Smads信号通路中重要基因Smad3、Smad7在人低分化结肠腺癌细胞株HCT-116中的表达，及AS2O3干预前后的变化情况，阐述TGF-β/Smads信号通路中Smads相关分子在肠癌HCT116细胞中有关分子的变化规律，探讨肠癌发生的病理机制和分析As2O3作用新靶点，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
As2O3购自哈尔滨伊达药业，人肠癌细胞HCT116由中科院上海细胞库提供，CO2培养箱购自日本SANYO公司，OLYMPUS倒置显微镜由奥地利生产，Smads抗体购于博奥森公司，其余二抗等购于武汉博士得公司。
1.2 细胞培养
复苏后的HCT116细胞接种于培养瓶中, 加入1640培养液(含热灭活胎牛血清,2 g/LNaHCO3,青霉素和链霉素各100 mg/L)中，置于恒温培养箱中培养(条件为37℃，5%CO2浓度及饱和湿度)，然后用0.15%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。
1.3 分组及药物处理
将5×104个/mL单细胞悬液接种在96孔培养板中，其中空白对照组加10%的培养液,用于试验的低剂量组加入0.5 μmol/L浓度的As2O3，中剂量组加1.5 μmol/L As2O3，高剂量组加2.5 μmol/L的As2O3液,在培养72 h后取出细胞用于实验。
1.4 间接免疫荧光术检测Smad3、Smad7蛋白的表达
收集对数生长期的HCT-116细胞,用0.15％胰酶消化成单细胞悬液后,以1×105/mL细胞浓度接种在放有玻片的24孔培养板中,1 mL/孔，37 ℃,5％CO2孵箱中培养72 h,待细胞贴壁后,弃去上清液,换成无血清的培养液，继续培养48 h后，吸尽上清液，PBS洗5 min×3次，取出玻片，中性树胶封片（有细胞面向上），过夜晾干，4 ℃保存备用，间接免疫荧光术检测，按试剂盒说明书进行操作（Smad蛋白抗体浓度为1∶100,荧光抗体浓度为1∶50），用荧光显微镜观察，结果以荧光强度表示。
1.5 westernblotting检测Smads相关蛋白表达
将上述各组As2O3处理过的培养细胞,用PBS进行漂洗，裂解细胞,离心然后灌凝胶上样，将蛋白样品加入50 μg/孔电泳分离，转至PVDF膜然后上摇床后用TBS封闭抗原1 h，加入一抗（Smad3、Smad7）,4 ℃过夜，TBS洗膜后加入二抗稀释液(用封闭液进行稀释，稀释浓度为1∶200 0)室温孵育膜lh，TBS洗膜3次，β-actin为参照，拍照。
1.6 统计方法
采用spss 12.0软件对数据进行统计分析, 计量资料用均数±标准差(x±s)表示，比较用 t检验。
2 结果
2.1 免疫荧光化学术检测Smad3,Smad7蛋白表达
见表1。
2.2 Westernblotting检测Smads相关基因
Smad3蛋白：对照组，及各浓度As2O3组相比较，Smad3蛋白表达逐渐增高，说明随着肿瘤细胞抑制作用的增加，Smad3表达增多，调控其下游信号的传导。见图2。
Smad7蛋白的表达：对照组，以及各浓度As2O3相比，Smad7蛋白表达逐渐减少，表明随As2O3浓度的增加，肿瘤细胞的受到抑制的作用增强，Smad7表达减少，减弱了对TGF-β/Smads信号通路的负反馈调节作用。见图3。
3 讨论
研究显示,与肿瘤发生高度相关的TGF-β/Smads信号通路由TGF-β超家族及其受体,Smads蛋白及其调节基因组成。TGF-β/Smads通路在肿瘤发生发展过程中会出现表达的异常，而使肿瘤细胞生物学行为改变[5]。目前比较清楚的是，在肿瘤发展的早期，TGF-β1能够抑制肿瘤细胞增殖，使细胞停留在G1期，诱导细胞凋亡，但在肿瘤晚期，该信号通路中的一些因子发生突变，使肿瘤细胞能够逃逸TGF-β1的抑制作用而发生增殖，这可能与TGF-β1下游的Smads分子表达异常有关，所以TGF-β/Smads通路在肿瘤中变化比较复杂。本研究中发现对照组Smad3为16.61±0.64，且随着三氧化二砷作用浓度的增加表达逐渐增加，当As2O3为2.5 μmol/L时，Smad3达到（39.64±1.63），各浓度三氧化二砷作用下的Smad3表达，相比正常对照组，均差异有统计学意义（P<0.05）。实验表明在体外培养的肠癌细胞HCT116中，随着肿瘤细胞数目的减少和细胞活动相对静止期时，Smad3表达逐渐增多，提示Smad3在肿瘤早期或相对稳定时表达较高。已有研究表明，缺乏Smad3 的小鼠在幽门螺杆菌感染和炎症反应下更易发生结直肠癌[6]，上述研究说明在肿瘤发展过程中，Smad3可能具有抑制肿瘤的作用，其中TGF-β1在肿瘤发展的早期具有抑制肿瘤发展的作用，也可能是通过Smad3的表达来实现的。在整个Smad信号通路中，除了上述调节型Smad 1，2，3等，还包括抑制型Smad 6、7，它们不直接参与信号的传递但对整个通路具有负调控作用。Smad7位于染色体 18q21 上, 该位点等位基因的丢失见于多种恶性疾病,并且与死亡率高,易发生转移有关。Smad7对 TGF-B家族的信号传递中起负反馈调节作用, Smad7表达的紊乱，可影响细胞对 TGF-β的应答, 从而促进细胞的恶性进展。Nakagawa 在体外实验中发现Smad7在胰腺癌中有较高的表达, 将Smad7基因转染至胰腺癌细胞，会使其恶性度增高, 裸鼠动物模型发生肿瘤机会增加, 提示 Smad7表达增高有可能促进肿瘤的发生[7]。同时Gulubova 等[8]在142 例结直肠癌患者中, 110 例肿瘤标本(77.4 %)中抑制性蛋白 Smad7 阳性表达, 119 例患者(76.3%)肿瘤细胞膜上 TGF-R表达阳性。该研究中，对照组 Smad7 阳性表达(38.61±0.64，2.5)μmol/L As2O3组则为(20.04±0.31)，即随着三氧化二砷对肿瘤细胞抑制作用的增强，Smad7表达逐渐减少，各浓度三氧化二砷用药组和对照组比较，P<0.05，差异有统计学意义，这与上述研究结果类似。在该研究中可能是三氧化二砷使肿瘤细胞表达Smad7减少，进而减弱了对TGF的反馈抑制作用，从而使TGF对其下游的Smad2,3等调控发挥作用，说明Smad7表达的异常是肠癌的重要分子特征。
该研究中Smad3、Smad7表达在4组中均差异有统计学意义, 提示两者均参与结肠癌的发生、发展过程，Smad3、Smad7表达的异常很可能成为结肠癌重要的分子特征，这还待于统计学上的筛选和确认，上述研究表明TGF-β/Smads信号通路可能是三氧化二砷发挥作用的重要靶点之一，上述基因只是肿瘤细胞增殖和凋亡等众多调控基因网络中的一员，Smads 与胞外信号调节激酶(MAPK)通路、核转录因子-κB(NF-κB) 等相互作用[9-11]，其间的更详细的因果关系以及机制有待进一步研究。
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（收稿日期：2014-05-02）