杨 津
湖南省湘潭市妇幼保健院妇产科，湖南湘潭 411100
[摘要] 目的 探讨宫颈癌中ADAMTS-1与MMP-9蛋白表达情况及意义。方法 收集本院2008年1月—2012年9月妇科收治的宫颈癌（实验组）37例、高级别宫颈上皮内瘤变26例与正常宫颈（对照组）10例样本。免疫印迹法检测各组ADAMTS-1与MMP-9蛋白相对表达。结果 方差分析结果显示，实验组ADAMTS-1表达量明显高于高级别上皮内瘤变组织（F=0.016，P=0.050），低于与对照组（F=-0.4306，P＜0.001）。实验组MMP-9蛋白的表达量明显高于高级别上皮内瘤变组织（F=0.3185，P＜0.001）与对照组（F=0.4477，P＜0.001）。实验组中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量呈负相关（P＜0.05）。结论 ADAMTS-1与宫颈癌中的发生有关，且可能通过上调MMP-9蛋白的表达途径实现。
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关键词 ] ADAMTS-1；MMP-9；宫颈癌；免疫印迹法
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）06（c）-0013-03
Expression of ADAMTS-1 and MMP-9 in human Cervical Cancers
YANG Jin
Xiangtan Maternal and Child Health-Care Hospital of Hunan Province Department of gynaecolgy and obstetrics ,Hunan 411100, China
[Abstract] Objective To explore the expression and clinical significance of ADAMTS-1 and MMP-9 in human cervical cancers. Methods Collected fresh tissues of 37 cervical cancers (experimental group), 26 high grade cervical intra-epithelial neoplasia(CIN Ⅱ-Ⅲ group), and 10 normal cervical (control group) in department of gynecology in this hospital from January 2008 to September 2012. Western blot analysis were performed to analyze the expression level of ADAMTS-1 and MMP-9 protein. Results Analysis of variance showed that, the expression of ADAMTS-1 in experimental group were significantly higher than the CIN Ⅱ-Ⅲ group (F= 0.016, P=0.050), but lower than the control group (F=-0.4306, P＜0.001). the expression of MMP-9 in experimental group were significantly higher than the CIN Ⅱ-Ⅲ group (F= 0.3185,P＜0.001), as well as the control group (F=0.4477, P＜0.001). Furthermore, MMP-9 expression was negatively correlated with ADAMTS-1 expression in experimental group (P＜0.05). Conclusion It is indicated that ADAMTS-1 plays a key role in the development of human cervical cancers, which could be attained by up-regulating MMP-9 expression.
[Key words] ADAMTS-1; MMP-9; Cervical Cancers ; Western blot analysis
宫颈癌是目前全世界最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌。近年来发病率明显升高，且逐渐呈年轻化改变。其具体发病机制尚未完全清楚，与HPV感染高度相关[1]。最新研究表明：基质金属蛋白酶(MMPs)的活性与癌症的侵袭转移能力密切相关。其中MMP-9可能参与人类宫颈癌的发生及转移过程[2-3]。
I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（A Disintegrin and Metallo-proteinase with Thrombospondin motifs，ADAMTS）家族是一类具有金属蛋白酶（MMP）特性的蛋白质[4]。目前，国内外学者对其与肿瘤发生发展的关系研究较少。其中，ADAMTS-1参与多种炎症损伤反应或血管修复过程，在多种炎性疾病尤其是前列腺癌的发生发展中发挥重要作用[5]。本研究应用免疫印迹法（Western blot）检测人类宫颈癌组织的ADAMTS-1、MMP-9蛋白表达情况，为该病的发生、侵袭转移机制提供新的线索。
1资料与方法
1.1一般资料
本组患者均为女性。收集本院2008年1月—2012年9月妇科收治的宫颈癌标本（实验组）37例，年龄36～64岁，平均年龄(49.3±3.2)岁；术后发现盆腔淋巴结转移者2例（5.4%）。26例高级别宫颈上皮内瘤变（CIN Ⅱ-Ⅲ级）标本取自宫颈利普刀切除患者，年龄28～46岁，平均年龄(38.4±4.6)岁。10例正常宫颈（对照组）样本取自行子宫肌瘤术切除全子宫的患者，年龄32～75岁，平均年龄(52.5±2.6)岁。
1.2 主要仪器与试剂
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒与western blot电泳槽、电泳仪、预染蛋白Marker、loading buffer、化学发光液等由本院中心实验室提供。RIPA蛋白提取裂解液与蛋白定量试剂盒均购自大连宝生物技术有限公司。兔单克隆ADAMTS-1抗体、鼠单克隆MMP-9 抗体、山羊抗兔、抗鼠二抗、内参GAPDH抗体均购自中杉金桥生物技术有限公司。
1.3免疫印迹法（Western blot）检测
收集新鲜宫颈癌、宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织标本与EP管中。按照一定比例加入RIPA裂解液提取总蛋白。在4℃环境中操作提取总蛋白，采用智能温控离心机进行高速离心时。遵照BCA法准确测量测定各组标本中蛋白浓度后，加入loading buffer于沸水煮样，多余蛋白液立即置入-80℃冰箱冻存备用。于电泳操作前45 min制备10％ SDS-PAGE分离胶，然后配制浓缩胶。每泳道上样量60 mg蛋白。等待样品蛋白跑到合适位置后将蛋白转移到PVDF膜上。凝胶电泳时电压80 V～120 V恒压，1.5～2.0 h，转印时电压45V，2.0 h。转印完毕后，将PVDF膜上的蛋白进行封闭、一抗4℃冰箱孵育过夜、二抗室温孵育2.5 h。完毕后，将PVDF膜充分洗涤后，加入plus-ECL化学发光试剂显影照相。
1．4 结果计算与统计分析
各组标本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的相对表达量为其灰度值/GAPDH灰度值。应用spss 19．0统计软件，方差分析或t检验用于比较各组标本两种蛋白的相对表达量，P＜0.05且在95%可信区间（Confidence Index，CI）表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 各组标本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的相对表达量
本组宫颈癌、CIN Ⅱ-Ⅲ级、对照组患者分别为37例、26例、11例。其ADAMTS-1蛋白相对表达量分别为：0.0307±0.0054（0.0289～0.0325）、0.0149±0.0037（0.0133～0.0164）、0.4613±0.08185（0.4063～0.5163）（图1）。三组标本中，MMP-9蛋白相对表达量分别为：0.4642±0.0918（0.4335～0.4948）、0.1456±0.0520（0.1246～0.1666）、0.0164±0.0057（0.0126～0.0203）（图2）。
2.2 统计分析
两组比较的方差分析显示各组标本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的表达差异情况。LSD检验结果显示：宫颈癌标本中ADAMTS-1蛋白的表达量明显高于高级别上皮内瘤变组织（F=0.016，P=0.050；95%CI：0.0001～0.0316），然而其表达量明显低于与对照组（F=-0.4306，P＜0.001；95%CI：-0.4518～-0.4093）。宫颈癌标本中MMP-9蛋白的表达量明显高于高级别上皮内瘤变组织（F=0.3185，P＜0.001；95%CI：0.2816～0.3554）与对照组（F=0.4477，P＜0.001；95%CI：0.3981～0.4973）。高级别上皮内瘤变组织标本中MMP-9蛋白的表达量明显高于对照组（F=0.1291，P＜0.001；95%CI：0.0772～0.1811）。非参数相关性检验（Kendall、Spearman检验）结果均显示：人类宫颈癌组织中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量呈负相关（P均＜0.05）（表1），而宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织标本中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量在无显著地相关性（P均>0.05）。
3讨论
ADAMTS蛋白家族广泛存在于哺乳动物中，是能够溶解细胞外基质的蛋白质。有19个家族成员，结构与MMP蛋白酶类似，有Zn2+结合位点。每个成员在不同年龄段、不同组织中表达有明显差异[6-7]。例如：成人的脑、神经、前列腺等组织均表达ADAMTS-13、17、18；而胚胎时期的肾脏、肺组织均主要表达ADAMTS-14、16、17、18等，肝脏组织主要表达ADAMTS-13、15、18[8-9]。与MMP蛋白家族相比，目前国内学者对ADAMTS的结构与功能研究较少。
ADAMTS-1属于分泌型蛋白,是目前研究较多的一个成员。其位于21号染色体长臂21~22，编码951个氨基酸，分子量为100kd左右。最早在小鼠结肠腺癌基因差异表达的研究中被发现[10-11]。ADAMTS-1有多个结构域，其中血小板凝血酶敏感蛋白样序列区（TSP）被认为是其主要功能区域。ADAMTS-1通过C末端3个TSP重复序列和间隔区锚定在细胞外基质中，可通过aggrecan、Versican、brevican 等蛋白来发挥降解细胞外基质蛋白的作用。人为干扰ADAMTS1的表达，可导致小鼠中TSP表达下降，进而引起组织血管增多、延长伤口愈合时间[12-13]。
肿瘤的发生是一个多步骤、多基因突变的过程。已证实，宫颈癌的发生可能与多种基因如HDAC1、DNMT1、RECK、P53、P2X7、MMP-9等基因突变及炎症相关蛋白表达异常有关[16]。部分研究表明：ADAMTS-1参与多种炎症损伤反应或血管修复过程与肿瘤的发生发展过程。C.Mastronard 等研究发现：IL-1β、IL-1可上调ADAMTS-1的表达，而TGF-β1则抑制其过度表达，从而维持炎症损伤反应的平衡。ADAMTS-1可通过降低VEGF的过表达进而抑制血管再生修复功能[14-15]。本组共74例标本，免疫印迹检测发现，慢性宫颈炎组标本中ADAMTS-1呈高表达状态，提示ADAMTS-1直接参与慢性宫颈损伤与炎症修复的重要功能。然而，其在高级别上皮内瘤变、浸润性癌组织的表达量明显降低（P均＜0.001），提示ADAMTS-1有抑制肿瘤发生的作用。然而，肿瘤组织中其表达下调机制目前尚未明确。
MMP-9蛋白在人类宫颈癌组织与Hela细胞中表达明显增强，并与癌症的侵袭、转移有关[2-3]。然而，其在宫颈高级别上皮内瘤变组织的表达却尚未清楚。本组高级别上皮内瘤变组织标本中MMP-9蛋白的表达量明显于高对照组（P＜0.001）。这一结果进一步证实MMP-9蛋白与宫颈癌的发生相关。然而，其表达量明显低于浸润性宫颈癌组织，提示着MMP-9的确参与癌症的侵袭、转移过程（P＜0.001）。
血管的长入是癌组织生长最关键因素，其主要步骤包括：血管内皮细胞的增值与迁移、毛细血管基底膜降解以及基底膜等再生等[17]。目前，越来越多的学者意识到：MMP与ADAMTS蛋白家族存在相互交联，然而其具体机制尚未阐明。一些皮肤损伤的研究发现：ADAMTS-1、MMP-2与FGF-2存在相互调节作用。上调ADAMTS-1的表达可促进FGF-2的高表达，进而促进成纤维细胞的聚集和迁移[18]。这一现象可能与ADAMTS-1促进MMP-2的高表达相关。此外，J.Kim等研究发现：动脉粥样硬化中ADAMTS-1高表达，基因敲除ApoE表达的转ADAMTS-1基因小鼠的血管内膜较ApoE正常表达的内膜明显增厚[19]。
本研究采用Kendall、Spearman等非参数相关性检验，进一步显示人类宫颈癌组织中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量呈负相关（P均＜0.05），而宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织标本中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量在无显著地相关性（P均>0.05）。这一结果提示：宫颈癌组织中ADAMTS-1的低表达引起肿瘤组织的血管生长失衡，炎性介质（MMP-9蛋白）释放增加，进而促进肿瘤的发生、发展。然而，ADAMTS-1与MMP-9蛋白的具体作用机制尚需进一步深入的研究来阐明。
与本研究类似，其他学者在乳腺癌、肝癌中研究发现：ADAMTS-1可能参与癌症的侵袭转移过程。ADAMTS-1低表达或缺失的肿瘤组织中，其肿瘤体积、血管数目与坏死度明显大于ADAMTS-1阳性组织。ADAMTS-1的上调能明显抑制肾、结肠组织的转移性肝癌的生长[20-21]。相反，最近研究结果显示：ADAMTS-1对癌症的转移具有促进作用，主要机制是ADAMTS-1促进可ECM中信号蛋白3C的释放与膜相关磷酸化肝素多聚蛋白-4的脱落，引起细胞黏附力减弱、进而促进癌症转移[22-23]。本组病例中，盆腔淋巴结转移者所占比例太少（仅5.4%），无法做出有意义的统计。因而，本研究尚未发现ADAMTS-1与宫颈癌预后有显著相关性。
4小结
综上所述，本研究初步检测了宫颈癌组织中ADAMTS-1与MMP-9蛋白表达情况。结果显示：宫颈癌中ADAMTS-1表达量明显下调、MMP-9蛋白表达量明显上调。宫颈癌中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量呈负相关，两者在宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织中的表达无显著地相关性。这一现象提示：ADAMTS-1可能与宫颈癌中的发生有关，且可能通过上调MMP-9蛋白的表达途径实现；为ADAMTS蛋白的深入研究打下了基础。然而，本研究的主要缺点在于实验样本太少、研究方法单一，更多可靠结论尚需更多研究来证实。
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（收稿日期：2014-03-21）