王 芳
常州市武进区疾病预防控制中心，江苏常州 213164
[摘要] 目的 研究分析PCR检测肠道病毒的方法评价及改进措施。方法 择取2013年8月—2014年8月期间在常州第一人民医院接受检测治疗的50例心血管内科急性心肌梗塞患者作为观察组，并抽取同期在该院体检的20例健康者作为对照组。分别采集两组研究对象的血清，均接受PCR方法检测，病毒分离与鉴定，CoxB V中和抗体检测，ELISA检测，并且实施肠道病毒病原与抗体检测，然后对比不同检测方法的结果。结果 观察组50例患者中，PCR检测得出EV-RNA阳性者20例，检出率为40%；病毒分离法分离出病毒4株，检出率为8%。通过ELISA检测得出的阳性者12例，阳性率为24%；CoxB V中和抗体检测出阳性为10例，阳性率为20%，二者之间存在显著性差异，P<0.05有统计学意义。结论 PCR检测方法具有一定的优越性，其敏感度、特异性更高。
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关键词 PCR检测方法；M-PCR检测方法；肠道病毒；改进措施
[中图分类号] R440 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）12（b）－０188-02
[作者简介] 王芳（1976.5-），女，江苏武进人，本科，主管检验师，研究方向：微生物检验。
1985年，Cetus公司与加利福尼亚大学联合创造了PCR技术[1]，其中主要的贡献人员为Kary BmuliS与Henery AErlich。PCR技术自产生之后就被广泛地应用于分子克隆、序列分析、传染病及考古研究等很多领域中，所发挥的作用越来越大。正是由于PCR技术的突出作用于贡献，KaryBmuliS在1993年获得了诺贝尔化学奖。医学界也开始渐渐关注并开始广泛使用PCR检测方法，通过引物的设计来完成对大类病毒的综合检测。虽然PCR技术有着独有的特点与优势，但是在对病毒检测的过程中依旧存在着一些不足之处，需要不断改进与优化。近20年来，PCR 分子生物领域具有革命性的技术突破，已在生命科学研究领域中得到了广泛应用。该研究对2013年8月—2014年8月在常州第一人民医院接受检测治疗的50例心血管内科急性心肌梗塞患者进行研究介绍肠道病毒的几种检测方法，重点介绍了PCR检测方式的原理、特点，对PCR检测技术应用于肠道病毒的检测进行了评价，通过4种肠道病毒检测方式的对比试验得出了相应的试验结果，证明了之后指出了PCR检测方法的发展，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
择取常州第一人民医院接受检测治疗的50例心血管内科急性心肌梗塞患者作为观察组，其中26例男性患者，24例女性患者。年龄范围36~85岁，平均年龄（61.02±6.63）岁。并抽取同期在该院体检的20例健康者作为对照组，其中男性11例，女性9例。年龄范围35~83岁，平均年龄（58.85±7.74）岁。两组研究对象之间的一般资料差异无统计学意义（P>0.05），试验可比性突出。
1.2 方法
1.2.1 PCR检测方法检测肠道病毒核糖核酸 肠道病毒RNA提取—取血清的样本100 μL，在血清中加入GITC变性液220 μL，加入氯放与异戍醇的按照49：1进行混合的液体50μL，加入pH值为4.0的NaAc30 μL，水饱和酚150 μL，将这些液体混合之后进行剧烈的振荡，然后在-20℃的温度直线冷却10 min，之后再进行5 min（13000 r/min）的离心运动，取出其中200 μL的液体，在其中加入200 μL的异丙醇，之后将新得到的液体在-20℃的环境之下静置1 h，再次进行10 min（13000 r/min）的离心运动，除去上部分的清液，将剩余部分利用乙醇进行洗涤沉淀之后自然挥发或者烘干之后放置备用[2]。
PCR方法检测肠道病毒RNA——PCR的成分与比例为双蒸水14.3 μL、10 X Buffer 2 μL、10 mmol MgCl2 3 μL，15 mmol dNTP 4μL，引物Q1 0.5 μL，Q2 0.5 μL，Taq酶 0.3 μL，逆转录酶AMV 0.3 μL；42℃恒温水浴逆转录30 min之后就能够实现RNA的扩增。扩增的程序为95℃变性进行5 min，60℃复性30 s，70℃延伸90 s，实现35个循环之后在进行70℃的延伸5 min。将扩增的产物取出5 μL之后加入酚蓝显示剂，之后将混合物点样在3%琼脂糖凝胶省，经过30 min 100V的电泳之后在紫外线之下观测结果[3]。
1.2.2 病毒分离与鉴定
利用常规的病毒分离与鉴定的方法对病人血清中的病毒进行分离，该种方法利用的是Hep-2细胞。当病人的血清出现细胞病变时，利用肠道病毒组合血清与Coxb V单价血清对其进行鉴定。这种病毒分离与鉴定的方法能够对血清与CoxB V1-6型毒株进行诊断。
1.2.3 CoxB V中和抗体检测 分步取患者在入院初与出院前采集的两次血清，通过自身分离病毒或者CoxB V1-6型作为抗原进行检测[4]。血清需要经过1：10稀释，稀释之后的血清要在55℃的环境之下进行30 min的灭活，之后经稀释的比例增加到1：320，将再次稀释后的血清与100 TCID50病毒进行等量的混合，将混合液置于35℃的环境之下进行1 h的结合，之后进行细胞接种，将细胞与病毒进行对照，终点为病毒被完全抑制、细胞病变终止。以阳性为标准进行判定，双份的血清抗体滴度升高的幅度大于4倍，单份血清与正常人的血清抗体滴度的比例大于1：80。
1.2.4 ELISA检测方法 取患者的血清样本，将血清在56℃的环境下进行30 min的灭活，然后在血清中以此加入酶结合物与底物，之后振荡1 min进行混合，将混合液进行倍比稀释（1：2~1：4000），之后将稀释液放置在96孔微量培养板中为生长液，每一个稀释度放置4个复孔。在复孔中加入50 μL病毒液，混合均匀之后在温度为37℃、还有2%二氧化碳的培养箱中进行培养。对培养箱中的情况观测5 d，之后用Reed-Muench方法进行结果的计算[5]。
Reed-Muench法：观察CPE， 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按以下公式计算出该病毒液的TCID50。
logTCID50=高于50%的病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数距离比例=（高于50%的百分数-50%）/（高于50%的百分数-低于50%的百分数）。
1.3 统计方法
选用统计学软件spss13.0对试验数据实施系统化处理，运用χ2对试验所得计数数据进行检验。当对比差异P<0.05时，差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR检测方法与病毒分离检测方法
50例患者中通过PCR检测方法检测出EV-RNA阳性的为20例，检出率为40%；病毒分离法分离出病毒4株，检出率为8%，其中CoxB 1型为1株、4型为2株、埃可病毒15型为1株。在PCR检测方法检测的20例阳性中，分离病毒检测出其中阴性的12例，两者共同检测为阳性的4例，两者共同检测为阴性的为34例，总符合率为81.9%（见表1）。两种方法对比之后差别非常显著，差异χ2=8.748，P<0.05，有统计学意义。对照组中的20例，病毒分离没有分离出病毒，PCR检测方法检测出阳性1例，误差率为2%。
2.2 ELISA检测方法与中和CoxB V中和抗体检测方法
50例患者中用ELISA方法检测阳性为12例，阳性率为24%；CoxB V中和抗体检测出阳性为10例，阳性率为20%；两种方法检测都为阳性的共10例。ELISA检测为阳性的12例中，CoxB V中和抗体检测方法检测为阴性的共2例，两种方法都为阴性的35例，总符合率为96.8%，两种方面差异无统计学意义（χ2=0.149，P>0.05）。见表2。
3.4 对比结果
通过上述的实验结果表明，PCR能够更加快速、特异与可靠的进行诊断，在当天就能够得到检测结果。在50例患者中阳性20例（40%），而病毒分离仅仅4例（8%）。在病毒分离阳性的4例中，PCR阳性4例，此外的16例PCR阳性病例病毒分离全部为阴性，因此PCR的敏感度较高，差异有统计学意义（χ2=8.748，P<0.05）。
3 讨论
PCR是体外DNA或RNA扩增的方法，这种扩增具有选择性[7]。通过对特定的微生物物种的特异性基因区域进行体外扩增，然后通过一定的DNA分析技术确定微生物的种类与含量。PCR反应主要包括三个阶段：对目标DNA系列进行加热变性；引物退火复性；在聚合酶作用之下DNA进行引物延伸。PCR检测方法特异性高，能够在较高的温度之下进行连续反应；敏感度高能够将微量的把DNA进行百万倍以上的扩增，能够满足检测分析所需要的DNA数量；反应速度快，PCR能够在2 h内完成30次左右的循环扩增；可扩增RNA或cDNA，能够利用寡脱氧胸昔引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将单链cDNA进行扩增，在mRNA很少的情况之下也能够进行序列分析。通用引物PCR特点为使用一对引物对多个模板进行同时扩增，但扩增产物大小相同，难以区分。多重PCR采用多对引物对多个模板同时扩增，按照产物片段不同长度进行鉴别，但是引物多，结果会产生一定差异。该研究肠道病毒检测中将二者结合，取长补短。
袁长青[7]等人研究发现，PCR检测方法是利用肠道病毒的特异性引物检测标本中和肠道病毒RNA同源的基因序列，将其作为判断结果的依据。对DNA进行重复的扩增之后检测方面的灵敏度能够增加大10-5~10-6 μg。该研究结果显示， 50例患者中通过PCR检测方法检测出EV-RNA阳性的为20例，检出率为40%，这说明PCR检测方法具有特异性高、敏感度高、速度较快，能够更加快速、特异与可靠的进行诊断。
朱坤[8]等人指出，在肠道病毒的PCR检测过程中也会出现一些问题。主要包含：假阳性问题，是指不应该出现阳性结果时出现了阳性结果；假阴性问题，是指在应该出现阳性结果的时候并没有出现阳性结果。该研究结果显示，在PCR检测方法检测的20例阳性中，分离病毒检测出其中阴性的12例，两者共同检测为阳性的4例，两者共同检测为阴性的为34例，总符合率为81.9%。由此可见，PCR技术灵敏度、特异性等方面有了较大的发展，而且已经在分子生物学等学科中得到了广泛的使用，有着不可比拟的优越性。虽然在某些方面依旧存在着一些局限性，但是随着PCR技术与其他各项技术的不断发展，将能够弥补这些缺陷，成为生物技术发展领域的趋势所在。
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参考文献
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[3] 裘湛，闻岳，黄翔峰.PcR-DGGE技术在水解酸化缺氧法处理采油废水的微生物研究中的应用[J].环境污染与防治，2006，28（6）：439-442.
[4] 吴小兵，董小岩，伍志坚.一种快速高效分离腺病毒伴随病毒的方法[J].科学通报，2010，45（19）：2071-2075.
[5] 沈晓丽.点免疫结合试验测定柯萨奇病毒B组抗体在临床的应用[J].中华心血管杂志， 2011 ，20（ 2）：1129-1134.
[6] 牛玉宏，杨英珍，虞勇.肠道病毒基因实时定量RT-cR方法的建立[J].复旦学报（医学科学版），2001，28（6）：542-544.
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[8] 朱坤，高秀杰，邓中平，等.肠道病毒71型实时荧光RT-PCR检测方法的建立及临床评价[J].热带医学杂志，2010，16（5）：414-415.
（收稿日期：2014-09-15）