牛兆仪 王 芳 靳 晴 顾 珏 余 霞 初正敏 李碧霞 李丽荣
昆明市延安医院妇产科，云南昆明 650051
[摘要] 目的 探讨妊娠合并HBV感染的孕妇母婴垂直传播的相关影响因素。方法 收集100例乙肝病毒携带孕妇及其100例新生儿作为研究对象，采用双抗体夹心时间分辨免疫荧光法（IFMA法）检测孕妇HBsAg和HBeAg，实时荧光定量PCR法检测HBV DNA载量，并用流式细胞仪检测新生儿脐血中NK细胞CD69和IFN-γ，并对以上指标的相关性进行统计分析。结果 母血中HBsAg单阳性与HBsAg/HBeAg双阳性组间母婴垂直传播比率差异有统计学意义（P＜0.001）；孕妇外周血HBV DNA载量越高母婴垂直传播几率越高。妊娠合并乙型肝炎患者中HBV母婴垂直传播组、未发生HBV母婴垂直传播患者与正常对照组三组间脐血中T淋巴细胞中活化标志物CD69表达的细胞百分比分别为：（9.58±1.745）%、（15.6±2.117）%和（5.66±3.724）%，差异有统计学意义（P＜0.001）。HBV母婴垂直传播与IFN-γ无明显相关性（P＞0.05）。 结论 母血HBeAg阳性与否、HBV DNA病毒载量高低直接决定着母婴HBV垂直传递的风险，同时T淋巴细胞中活化标志物CD69表达水平与母婴HBV垂直传播相关，该研究的结果为临床研究HBV母婴传播的机理及其预防措施，减少HBV携带者，提高新生儿出生质量有重要意义。
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关键词 HBV感染；母婴垂直传播；影响因素
[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）10（a）－０044-03
我国是乙型肝炎的高发区，母婴传播是乙型肝炎病毒（HBV）传播的一条重要途径，亚洲HBV感染者中有30%～50%是通过母婴传播形成的，我国每年约26万新生儿通过母婴传播途径感染HBV[1]，阻止母婴传播是控制乙肝流行的主要环节。大量的研究发现NK细胞在HBV感染早期的病毒清除和慢性HBV感染患者肝脏病变过程中都起到了十分重要的作用，但关于NK细胞在HBV母婴传播中的作用并不清楚，因此，该研究检测妊娠合并HBV感染的孕妇及其新生儿的外周血的HBsAg、HBeAg以及HBV DNA载量，并检测脐血中NK细胞表面IFN-γ和CD69的表达水平，以探讨NK细胞在HBV在母婴传播中的作用。报道如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
根据2005年中华医学会肝病学分会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准，选择2009年1月—2013年12月在云南省昆明市延安医院妇产科分娩的无症状乙肝病毒携带孕妇共计100例（母血中HBsAg单阳性、HBsAg /HBeAg双阳性）及其新生儿100例作为研究对象。所选病例孕期均无先兆流产或先兆早产及妊娠期高血压病史以及无其他原发性疾病，肝功能正常，孕期未使用其他研究药物或全身抗病毒、细胞毒性、类固醇激素或免疫调节剂等药物。另外，收集同期就诊的乙型肝炎病毒携带隐性的健康孕妇分娩的新生儿脐血40例作为正常对照，其中病例组与正常对照组间分娩时胎龄均在36~41周之间，分娩方式均按正常待产拟定治疗方案，两组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2 研究方法
1.2.1 标本采集 孕妇分娩前采集静脉血3 mL，分两份分离血清，分别进行HBV DNA 检测和乙型肝炎5项检测。新生儿于分娩时在碘伏消毒过的脐带处采集脐血5 mL，分离血清做HBV DNA检测，分娩12 h内采集桡动脉血，分离血清储存于-20 ℃中保存待测。
1.2.2 检测方法 ①乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）采用双抗体夹心时间分辨免疫荧光法（IFMA法）：采用WALLAC公司1235全自动时间分辨荧光测定仪对妊娠合并乙型肝炎患者、新生儿、新生儿脐带血进行乙肝两对半定量检测。②HBV DNA 定量检测采用荧光定量PCR 法（美国Bio-Rad公司的DA7600型核酸扩增实时荧光检测系统及上海夏华生物医学工程有限公司实时荧光定量PCR试剂盒），分别设计一堆乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，用PCR体外扩增发定量检测乙型肝炎病毒DNA，标本的HBV DNA 含量以copies/ ml 表示。③新生儿脐血中NK细胞CD69和IFN-γ采用流式细胞仪（美国BD公司的FACS-Calibur流式细胞仪）检测，取CD3、CD56和CD69抗体（Biolegend公司提供）各5 μL和100 μL血样混匀避光孵育20 min，然后加入1 mL溶血素混匀作用5 min，离心弃上清后加入1M1×LPBS，再离心并弃上清，加入200 μL 1×LPBS上机检测。
1.3 新生儿HBV感染的判定标准
HBV 感染判定标准新生儿外周血HBsAg阳性和/或HBV DNA 阳性判定为HBV感染存在。
1.4 统计方法
采用spss17.0统计软件包进行统计学分析。运用四格表确切概率法及χ2检验比较组间差异。计量资料均以均数±标准差（x±s）表示, 两组样本组间比较采用t 检验，两组以上均数比较采用方差分析。
2 结果
2.1 母血中HBsAg、HBeAg与HBV母婴垂直传播的关系
ELISA法检测100例妊娠合并乙型肝炎病毒感染的孕妇，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）单阳性发生母婴垂直传播率为1.75%；乙肝表面抗原及e抗原（HBsAg /HBeAg）双阳性患者发生母婴垂直传播率为46.51%，患儿桡动脉血乙肝两对半检测为HBsAg 或HBeAg阳性，采用χ2检验对结果进行分析，见表1。（HBsAg正常值0~0.2 ng/mL、 HBeAg正常值0~0.5 PEIU/mL）。母血中HBsAg单阳性与HBsAg/HBeAg双阳性其发生HBV母婴垂直传播率差异有统计学意义（P<0.001），可认为母血中HBsAg单阳性与HBsAg/HBeAg双阳性与发生HBV母婴垂直传播有相关性。
2.2 母血外周血HBV DNA病毒载量与HBV母婴垂直传播的关系
产妇外周血HBV DNA按病毒载量由低到高分为3组：HBV DNA≤105 copies/mL、105 copies/mL<HBV DNA<106 copies/mL、HBV DNA≥106 copies/mL，这3组产妇分娩的新生儿分别有56例、4例和40例，相应的新生儿桡动脉血HBV DNA 阳性率分别为0%（0/56）、25%（1/4）、50%（25/50）。孕妇外周血HBV DNA载量越高，其新生儿HBV DNA阳性率越高，且组间差异有统计学意义（P<0.001）。见表2。
2.3新生儿脐血NK细胞表面IFN-γ和CD69表达水平与HBV母婴垂直传播的关系
妊娠合并乙型肝炎患者中HBV母婴垂直传播组脐血中T淋巴细胞中活化标志物CD69表达的细胞百分比为（9.58±1.745）%，未发生HBV母婴垂直传播患者脐血中T淋巴细胞中活化标志物CD69表达的细胞百分比为（15.6±2.117）%；正常对照组为（5.66±3.724）%，3组间T淋巴细胞中活化标志物CD69表达的细胞百分比差异有统计学意义（P<0.001）。见图1。可认为HBV母婴垂直传播与CD69表达具有相关性。而IFN-γ的表达在3组间差异无统计学意义。
3 讨论
发生HBV母婴垂直传播有3种可能的途径：产前传播、产时传播和产后感染，目前普遍认为分娩过程中的HBV感染是围产期感染的主要途径。HBV宫内感染难以阻断，并且是新生儿HBV感染的主要途径。
该研究结果显示，HBV母婴垂直传播与母血中HBsAg单阳性与HBsAg/HBeAg双阳性，母婴垂直传播比率差异有统计学意义（P＜0.001），许多研究也得到与该研究相同的结论，新生儿HBV感染和母亲血清中e抗原阳性明显相关[2]。乙型肝炎e抗原是存在于病毒颗粒之外的一种可溶性蛋白，有研究发现，HBeAg能够通过胎盘，引起胎儿对HBeAg的T细胞耐受，从而导致免疫功能低下，在这种情况下，暴露于高浓度母血HBV的胎儿就更容易被感染。因此，HBeAg不仅仅是高传染性的标志，其本身也可能通过影响胎儿免疫系统，从而增加感染的风险[3-5]。研究发现HBV宫内感染主要在孕晚期经胎盘感染胎儿，随着孕妇血清HBV DNA水平增高，胎儿发生宫内感染的危险性呈增高趋势[6]。当孕妇血清中HBV DNA水平>108拷贝/mL时，即使采用产后双重免疫宫内感染仍可达43%左右[6]，而母血中HBV DNA水平在106拷贝/mL以下时，将减少30%的HBV宫内感染母婴垂直传播危险[7]。该研究结果显示，随孕妇外周血HBV DNA病毒载量水平增高，胎儿发生HBV母婴传播风险呈增高趋势：妊娠合并乙型肝炎患者外周血HBV DNA病毒载量＜105 copies/mL的患者未发现母婴垂直传播；母血HBV DNA病毒载量大于105 copies/mL的产妇可能母婴传播，尤其是母血HBV DNA病毒载量＞106 copies/mL的产妇，50%发生母婴HBV传播。因此，HBV DNA是反映HBV携带者传染性的直接指标，孕妇血清HBV DNA水平确实与母婴HBV传播有关，且母血HBV DNA高载量（≥106 copies/mL）可能是HBV母婴传播的高危因素。
CD69被称为早期激活抗原或活化诱导分子，是表达经抗原刺激后各种激活T细胞、NK 细胞、B 细胞、单核巨噬细胞、中性和嗜酸粒细胞、胸腺细胞表面，当其表达后，可作为共刺激信号促进T 淋巴细胞进一步活化和增殖。Goncalves等[8]通过对HBV疫苗的研究发现T细胞CD69表达与HBV感染关系密切，认为T细胞CD69表达的降低是机体对HBV无反应的结果。该研究发现，健康产妇组的脐血T淋巴细胞中活化标志物CD69表达的细胞百分比处于低水平（5.66%），而妊娠合并乙型肝炎患者发生母婴HBV垂直传播组和未发生HBV母婴垂直传播组脐血中T淋巴细胞中活化标志物CD69表达的细胞百分比高于正常对照组，特别是妊娠合并乙型肝炎患者未发生HBV母婴垂直传播组脐血中T淋巴细胞中活化标志物CD69表达的细胞百分比（15.6%）显著高于垂直传播组（9.58%）。可见，CD69的表达与HBV母婴垂直传播有相关性。T淋巴细胞中活化标志物CD69表达的细胞百分比的升高有利于机体免疫系统对HBV的清除，从而降低HBV母婴垂直传播的风险。
IFN-γ主要由活化的NK 细胞和Th 细胞产生，其生物学功能主要是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHCⅠ/Ⅱ分子，活化单核、巨噬细胞并增强其溶菌活性及分泌IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等, 也是促进T细胞分化和CD8+CTLs成熟的重要因子[9]。研究发现，Th1细胞分泌的IFN-γ能在转录后水平抑制肝炎病毒，同时IFN-γ诱导及活化NK细胞，又能通过免疫调节增强机体的防御能力。NK细胞IFN-γ表达量的增加可能在HBV清除中起到十分重要的作用[10]。该研究结果显示，妊娠合并乙肝病毒感染的孕妇发生HBV垂直传播组、非垂直传播组和正常对照组NK细胞表面IFN-γ表达的差异无统计学意义。因此IFN-γ表达与HBV母婴垂直传播的相关性有待进一步的研究。
综上，该研究发现母血HBeAg阳性与否、HBV DNA病毒载量高低直接决定着母婴HBV垂直传递的风险，同时T淋巴细胞中活化标志物CD69表达水平与母婴HBV垂直传播相关，该研究的结果为临床研究HBV母婴传播的机理及其预防措施，减少HBV携带者，提高新生儿出生质量有重要意义。
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参考文献
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（收稿日期：2014-06-24）
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