李紫燕1 张 翼2 张士虎2
1.常州市肿瘤医院病理科，江苏常州213000；2.江苏省中医院急诊外科，江苏南京 210029
[摘要] 目的 探讨ERCC1基因在胃癌中的表达及临床意义。方法 应用实时荧光定量PCR检测44例胃癌组织中ERCC1基因的表达，并分析ERCC1 基因表达与患者生存的关系。结果 ERCC1在胃癌组织中的表达与年龄、组织学分级、淋巴结转移、临床分期等因素无关，而与性别有关。ERCC1高表达病例3年生存率33.3％(8/24) ，ERCC1低表达病例3年生存率60.0％(12/20)，ERCC1低表达患者3年生存率更高,但是两者差异无统计学意义(P=0.077)。结论 ERCC1与胃癌分化程度、有无淋巴结转移等无关，提示ERCC1与肿瘤的不良生物学行为无关。ERCC1基因在胃癌中不能作为独立的预后指标。
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关键词 ] 胃癌；Q-PCR；ERCC1；预后
[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）10（a）-0026-03
[通讯作者] 张翼(1979-),男,江苏省如皋市人,硕士研究生,主治医师,研究方向:普外科。
[作者简介] 李紫燕(1987-),女,江苏省常州市人,本科,初级病理技师,研究方向:分子病理。
胃癌是全世界第二大致死性癌症，尤其是进展期胃癌（AGC）和胃-食管交界部癌(GEJ)患者的临床生存率普遍较差，传统化疗方案的中位生存期为9~11个月。顺铂和5-氟尿嘧啶(5-FU) 是胃癌治疗的经典化疗药物，但是胃癌是异质性很强的肿瘤，病理类型的差异、遗传因素和发生部位的差别都可以导致胃癌疗效差异显著。有研究发现,DNA修复家族成员核苷酸切除修复基因1（ERCC1)是较好的化疗疗效预测指标,低表达患者铂类药物敏感,疗效较好[1] 。ERCC1基因表达在胃癌中的作用尚没有定论，胃癌患者ERCC1表达水平与预后的关系仍存在着争议。本研究利用胃癌石蜡标本, 用RT-QPCR方法进行检测并对该基因的临床意义进行分析。
1资料与方法
1．1临床与病理资料
标本44例胃癌石蜡标本及对应的血液标本(2008年1月—2010年8月) 由江苏省中医院病理科提供。其中男性31例, 女性13例，年龄36~80岁,中位年龄60岁。组织学分级高分化2例，中分化8例，低分化34例；肿瘤部位胃-食管交界部癌3例，胃癌41例；有淋巴结转移者38例，无淋巴结转移者6例。所有病例术前均无铂类化疗史。所有病例均由病理诊断证实。
1．2基因组RNA抽提及RT－QPCR
按照试剂盒说明提取石蜡RNA (RNase－free FFRE Kit, Qiagen)和血RNA (Blood RNA Kit,Omega)。取1μL RNA加99 μL RNase Free ddH2O,在紫外分光光度仪上测定其浓度和纯度。进一步行RT反应(10μL):gDNA:1μL,6μlRNA＋DEPC H2O,42℃ 2 min,然后加入0.5μL Primer(10nmol/μL),0.5μL RT 酶,2μL Buffer,42℃ 30 min, 95℃ 5 min。QPCR反应体系(5μL) :Master Mix: 2.5μL,模板cDNA 1μL, ERCC1上下游引物各0.25μL (20pmol/μL)，H2O:1μL。PCR 扩增条件: 95℃ 10min 预变性,95℃ 15 s, 60℃ 1min 扩增50 个循环。溶解曲线的温度设定: 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 95℃ 15 s。
1．3 SYBR Green荧光实时定量PCR数据分析
以ACTB基因为内参,利用待测样本的Ct值(3复管均值) 求出相应基因拷贝数作为检测结果。Ct值阈值纳入范围设置为15～35个循环。
1．4 随访
对44例胃癌患者及其家属于2013年8月进行电话随访。所有患者的随访内容包括性别、年龄、确诊日期、手术日期、死亡日期、死亡原因 (截止于2013年8月31日)。
1．5统计学分析
数据处理使用spss 13.0软件。计量数据用（x±s）表示。计数资料使用χ2检验、Fisher’s确切概率法进行显著性检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 ERCC1基因在胃癌中表达的情况
44例胃癌组织中ERCC1与内参的差值Δct与cut off值4.3[2]相比较,低表达和高表达者分别为27例和17例。
2.2 ERCC1基因表达与胃癌病理学特征的关系
研究结果显示：胃和胃食管交界部位癌相比较，ERCC1的表达高低没有统计学差异（P>0.05）；不同的组织学分级和临床分期在ERCC1高表达组与低表达组中也没有显示出统计学差异（P>0.05）。ERCC1基因的表达与发病性别有关,与年龄、肿瘤部位、组织学分级、淋巴结转移情况、临床分期无关。ERCC1基因低表达在女性患者中(12 /13, 92.3% )所占比例与男性患者(15/31，48.4% )相比较有显著统计学差异，见表1。
2.3 ERCC1基因表达与胃癌患者生存的关系
随访病例三年生存率为45.5%。本实验将44例获得随访的胃癌患者分成两组：生存组20例，其中低表达者12例，高表达者8例；死亡组24例，其中低表达者8例，高表达者16例，并对两组中ERCC1基因表达情况作了分析。胃癌中ERCC1低表达在死亡组中为33.3%(8/24)，低于生存组60.0%(12/20)，两组比较差异没有显著统计学意义(χ2=3.129，P=0.077)。
3 讨论
ERCC1是细胞内DNA损伤修复通路中的关键基因，具有核苷酸切除修复系统（NER）的重要功能。多项研究显示ERCC1低表达患者可从辅助化疗获益，ERCC1高表达患者则不能从辅助化疗中获益[3-4]。目前ERCC1基因表达在胃癌中的作用尚不明确，国内研究[5-7]多采用免疫组化的方法检测ERCC1蛋白的表达，本研究应用实时荧光定量PCR的方法，更能准确地从基因水平上检测胃癌中ERCC1的表达情况。徐大洲[5]，宋延强[6]等研究表明ERCC1在胃癌表达与性别、年龄、组织学类型、淋巴结转移及TNM分期无关，但都是采用免疫组化的方法从蛋白水平上检测表达。免疫组化有其自身的局限性，例如判读结果往往带有主观性并依赖于制片质量的好坏。本研究采用实时荧光定量PCR方法对44例胃癌组织进行ERCC1基因表达水平的检测，结果显示ERCC1在肿瘤组织中表达与年龄、肿瘤部位、组织学分级、淋巴结转移及临床分期无关，但是与性别有关。在国外一项2540例非小细胞肺癌参与的大型研究结果显示[8],ERCC1表达水平在男女中有显著差异,女性更易低表达,和本研究结果相似，提示了女性更易从辅助化疗中获益。Jina[9]等用免疫组化方法检测了89例进展期胃癌的ERCC1表达，结果显示ERCC1蛋白表达并不能用于指导化疗的反应性及预后的判断。而徐大洲等对85例I～III期胃癌患者进行了回顾性研究，结果显示ERCC1蛋白可预测胃癌术后铂类辅助化疗的敏感性，ERCC1蛋白表达水平是胃癌术后患者独立的生存预后因素，与国外研究结论不一致。本研究结果显示尽管ERCC1低表达患者3年生存率更高,但是两者差异无统计学意义，尚不能作为独立的生存预后因素，与国内报道[5]不一致的原因可能是由于检测方法及检测水平不同所致，还可能是由于肿瘤的分期不同所致。
关于胃癌组织中ERCC1基因表达对铂类药物敏感性的预测作用和对胃癌治疗后生存期的影响的研究还在进行中。国内外研究[6-11]显示ERCC1表达可能与进展期胃癌患者的化疗敏感性及预后有关，ERCC1低表达患者生存期较高表达患者生存期延长。王琼[12]等对120例进展期胃癌进行了ERCC1基因mRNA表达水平的检测，并根据检测结果针对性的选择化疗方案，使得有效率从常规化疗的40%提高到58％。但是ERCC1基因在胃癌中是否能作为独立的预后指标尚具争议。最新ASCO会议报道ERCC1不能作为肺癌的独立预后指标[13]，其在肿瘤中的作用还需要进一步研究。本研究结果显示ERCC1高表达病例3年生存率33.3％，ERCC1低表达病例3年生存率60.0％，低表达者生存率比高表达者高，但是两者差异无统计学意义（P=0.077），提示ERCC1基因在胃癌中尚不能作为独立的预后指标。对于ERCC1基因的表达在胃癌预后中的意义需要进行更大样本的多中心研究。
总之,目前结果显示ERCC1低表达者生存较好，可能与铂类化疗敏感相关。因此,检测术后患者ERCC1基因的表达有助于指导胃癌的个体化治疗，值得在临床中进一步推广研究。
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（收稿日期：2014-07-15）