摘 要：目的：研究白及胶/微米三七膏含药血清通过核因子（NF）-κB信号通路对脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症损伤模型的影响。方法：取对数生长期的RAW264.7细胞，用不同浓度（5、10、15、20、25μg/mL）的LPS处理，采用CCK-8法检测细胞增殖率，确定LPS的最佳浓度，并诱导建立RAW264.7细胞炎症损伤模型；将细胞分为正常对照组、LPS组和不同浓度梯度（50、100、150、200、250、300μL/mL）的白及胶/微米三七膏含药血清+LPS组，用CCK-8法检测各组光密度（OD）值，确定含药血清最佳使用浓度；将细胞分为正常对照组、空白血清组、含药血清组、LPS组、LPS+空白血清组和LPS+含药血清组，用Western blotting法测定细胞浆/细胞核NF-κB p65蛋白表达量和细胞浆p-IκBα蛋白表达量。结果：LPS最佳浓度为10μg/mL；白及胶/微米三七膏含药血清最佳浓度为250μL/mL；与正常对照组相比，LPS组细胞浆NF-κB p65蛋白表达量显著降低、细胞核NF-κB p65和细胞浆p-IκBα蛋白表达量显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）；与LPS组相比，LPS+含药血清组细胞浆NF-κB p65蛋白表达量显著增高、细胞核NF-κB p65和细胞浆p-IκBα蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：通过NF-κB信号通路，白及胶/微米三七膏含药血清通过抑制NF-κB p65进入细胞核和抑制I-κBα的磷酸化，减少巨噬细胞分泌炎性因子，从而改善LPS诱导的炎症反应。
关键词：白及胶/微米三七膏 NF-κB信号通路 脂多糖 糖尿病足溃疡
Study on Effect of Hyacinth Bletilla/Micron Pseudo-ginseng Salve Drug-containing Serum on LPS-induced Inflammatory Injury Model of Macrophages by NF-κB Pathway
XIE Yu ZHANG Kang ZHANG Jin-mei
Department of General Surgery, Shaanxi University of Chinese Medicine;
Abstract：Objective To explore the effect of Hyacinth Bletilla/Micron Pseudo-ginseng salve drugcontaining serum on LPS-induced inflammatory injury model of macrophages by NF-κB pathway. Methods The RAW 264. 7 cells at logarithmic growth stage are processed with lipopolysaccharide(LPS) at different concentrations( 5, 10, 15, 20, 25 μg/m L). Its proliferation rate is detected by CCK-8 method. The optimal LPS concentration is determined and the RAW264.7 model of inflammatory injury is established. The cells are divided into normal control group, LPS group and Bletilla/Micron Pseudo-ginseng drug-containing serum + LPS group with different concentration gradient(50, 100, 150, 200, 250, 300 μL/m L). The OD value of each group is detected by CCK-8 method to determine the optimal concentration of drug-containing serum. The cells are divided into normal control group, blank serum group, drug-containing serum group, LPS group, LPS + blank serum group and LPS + drug-containing serum group. The protein expression levels of NF-κB p65/p-IκBα in cytoplasm and nuclear are determined by Western blotting. Results The optimal concentration of LPS is 10 μg/m L. The optimum concentration of drugcontaining serum is 250 μL/m L. Compared with the normal control group, the protein expression levels of NF-κB p65 in cytoplasm are significantly decreased in LPS group. The protein expression levels of NF-κB p65 in nuclear and p-IκBα in cytoplasm are significantly increased in LPS group(P < 0. 01).Compared with the LPS group, the protein levels of NF-κB p65 in nuclear are significantly increased, NF-κB p65 in nuclear and p-IκBα in cytoplasm are significantly decreased in LPS + containing serum group(P <0.01). Conclusion Bletilla/Micron Pseudo-ginseng drug-containing serum inhibits NF-κB p65 entry into the nucleus and IκBα phosphorylation and reduce macrophage secretion of inflammatory cytokines, thereby improving LPS-induced inflammatory reaction by NF-κB signaling pathway.
Keyword：Hyacinth Bletilla/Micron Pseudo-ginseng salve; NF-κB pathway; LPS; diabetic foot ulcer;
脂多糖（LPS）是革兰阴性菌外膜的重要组成成分，被定义为毒力因子和血清型特异免疫原[1-2]。在介导炎症反应的过程中，巨噬细胞起最主要作用，正常时呈静息状态，受刺激后，能分泌出多种炎性介质[3]。因此，利用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞发生炎症反应，并通过药物干预来观察药物对炎症反应的影响，已经成为实验中常用的模型[4]。糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer,DFU）是一种慢性难愈性溃疡，该病发生发展周期较长、治疗费用高、预后效果差，给患者造成了沉重的负担。在DFU创面炎症反应中，巨噬细胞激活核因子（NF）-κB的结合活性，上调多个相关炎性基因表达产生大量炎性因子，如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL)-1β等。TNF-α可增加线粒体生成，加剧氧化应激，激活IκB激酶（IKK），更进一步刺激NF-κB，使之释放更多炎性因子，形成慢性低度炎症信号的正反馈[5-6]。本课题组前期研究发现白及胶/微米三七膏具有促进DFU慢性溃疡创面肉芽组织修复及抑制炎性细胞因子的功效[7]，但具体机制尚不明确。本研究在此基础上应用白及胶/微米三七膏含药血清作用于LPS诱导的RAW264.7细胞炎症损伤模型，进一步探讨基于NF-κB信号通路白及胶/微米三七膏含药血清改善炎症反应的机制，从而为DFU的防治提供新思路。
1 材料与方法
1.1 细胞
小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.2 药物
白及胶/微米三七膏含药血清，陕西省中药资源产业化协同创业中心制作。制备方法：将水体醇沉法提取的白及胶与振动机细胞级超微粉碎机制取的微米三七粉按照1.5︰1、3︰1、6︰1比例放入烧杯，加入蒸馏水，加热并搅拌药液2 h，过滤药液，将药渣再次加热过滤，合并两次过滤液，浓缩至1 g（生药）/m L，即白及胶/微米三七膏。将制备好的白及胶/微米三七膏分组给予大鼠灌胃，连续7 d后自腹主动脉采血，抽取血清。经前期实验证实白及胶/微米三七膏含药血清最佳比例为6︰1，本次选用6︰1浓度的白及胶/微米三七膏含药血清进行实验。
1.3 主要试剂与仪器
脂多糖，美国SigmaAldrich公司；RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒均购自博士德生物工程有限公司；蛋白Marker、PVDF膜，上海碧云天生物技术有限公司；ECL显影定影试剂，美国Thermo Fisher scientific公司；蛋白提取试剂盒，上海贝博生物科技公司；一抗NF-κB p65、p-IκBα、β-actin、Histone H3、二抗HRP标记山羊抗兔Ig G为沈阳万类生物科技有限公司产品。
1.4 检测建立RAW264.7细胞炎症损伤模型的LPS最佳浓度
将RAW264.7细胞设置为正常对照组及不同浓度（5、10、15、20、25μg/m L）的LPS组，前者加入RPMI-1640基础培养基，后者依次加入不同浓度梯度的LPS溶液，用CCK-8法得到各组光密度（OD）值及细胞增殖率，最终筛选出LPS的最佳浓度。
1.5 检测白及胶/微米三七膏含药血清最佳浓度
取对数生长期的RAW264.7细胞，设置为正常对照组、LPS组（最佳浓度）和不同浓度梯度（50、100、150、200、250、300μL/m L）的白及胶/微米三七膏含药血清+LPS组。在对照组中加入RPMI-1640基础培养基，其他组均加入LPS（最佳浓度）溶液，培养2 h后加入不同浓度梯度的白及胶/微米三七膏含药血清，采用CCK-8法检测各组的OD值，确定白及胶/微米三七膏含药血清的最佳浓度。
1.6 细胞培养
将细胞分为正常对照组、空白血清组、含药血清组、LPS组、LPS+空白血清组和LPS+含药血清组。前3组中加入RPMI-1640基础培养基；后3组中加入LPS（最佳浓度）培养2 h；在含药血清组和LPS+含药血清组中加入最佳浓度的白及胶/微米三七膏含药血清；在空白血清组与LPS+空白血清组中加入空白血清共同干预22 h。培养完成经离心后，按组分装于离心管中。
1.7 Western blotting法检测细胞浆/细胞核NF-κB
p65蛋白水平和细胞浆p-IκBα蛋白水平细胞培养方法和分组同1.5，解冻样品，首先将细胞用RIPA裂解液处理，离心后取上清，根据试剂盒说明提取胞核和胞浆蛋白，制备蛋白质待测液，加入BCA工作液，放于37℃环境中20 min，用酶标仪在波长为562 nm处测其OD值，计算样品蛋白浓度。经过60 V、90 V、120 V电压SDS-PAGE凝胶电泳，在380 mA电流中转膜90 min，再经过封闭1 h、TBST洗膜、一抗、二抗孵育，最终用ECL试剂显影、定影。对实验数据进行统计学分析，观察白及胶/微米三七膏含药血清对细胞浆/细胞核NF-κB p65及细胞浆p-IκBα蛋白表达的影响。
1.8 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用t检验，采用Graph Pad 8.0软件进行数据统计和制图，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS最佳浓度
LPS诱导RAW264.7巨噬细胞24 h后，相比正常对照组，5、15、20及25μg/m L的LPS溶液对诱导RAW264.7细胞影响较明显，差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组OD值为1.072±0.102,10μg/m L的LPS溶液对诱导RAW264.7细胞影响最显著，OD值为2.045±0.060，差异有统计学意义(P<0.01)。因此，本次建模选用10μg/m L的LPS溶液作为最佳浓度。见表1。
表1 LPS作用对巨噬细胞增殖的影响
2.2 白及胶/微米三七膏含药血清最佳浓度
不同浓度梯度的白及胶/微米三七膏含药血清的OD值均高于正常对照组，且低于LPS组。在白及胶/微米三七膏含药血清干预LPS诱导的炎症模型24 h后，100、150、200、300μL/m L的白及胶/微米三七膏含药血清抑制LPS诱导的炎症模型较为明显，差异有统计学意义（P<0.05）。正常对照组OD值为1.111±0.113。250μL/m L白及胶/微米三七膏含药血清对LPS诱导的炎症模型抑制最显著（P<0.01),OD值为1.300±0.016。因此，选择250μL/m L的白及胶/微米三七膏含药血清作为本研究含药血清组的最佳浓度。见表2。
2.3 白及胶/微米三七膏对细胞浆和细胞核NF-κB p65蛋白表达量的影响
含药血清组、空白血清组与正常对照组细胞浆NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。LPS组相比正常对照组显著降低，LPS+含药血清组相比LPS组显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。含药血清组、空白血清组与正常对照组细胞核NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。LPS组相比正常对照组显著增高，LPS+含药血清组相比LPS组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图2。
表2 白及胶/微米三七膏对巨噬细胞炎症模型的影响
图1 白及胶/微米三七膏对细胞浆NF-κB p65蛋白表达的影响
图2 白及胶/微米三七膏对细胞核NF-κB p65蛋白表达的影响
2.4 白及胶/微米三七膏对细胞浆p-IκBα蛋白表达的影响
含药血清组、空白血清组与正常对照组差异无统计学意义（P>0.05）。LPS组相比正常对照组显著增高，LPS+含药血清组相比LPS组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图3。
图3 白及胶/微米三七膏对细胞浆p-IκBα蛋白表达的影响
3 讨论
DFU是糖尿病患者中晚期严重的慢性并发症之一[8]，目前有关DFU的现代医学治疗方法尚未有新的突破，课题组研制的“白及胶/微米三七膏”作为院内制剂，用于临床诊疗，效果满意。白及可止血消肿，生肌敛疮，消炎止痛[9]。白及胶是从白及块茎中提炼出的，主要成分为葡萄糖和甘露糖，并通过糖苷键聚合而成的水溶性多糖，是一种天然高分子材料，可作为安全有效的生物医学材料[10]。三七有化瘀生新、止血定痛的作用，三七超微粉碎后可以破坏植物细胞的细胞壁，有利于其有效成分三七总皂苷(PNS)溶出[11-12]，杨煜等[13]通过实验证实PNS能增加凝血的时间，降低血小板、红细胞的聚集和黏附，使血液黏稠度降低，起到活血化瘀的作用。它还能明显减轻因缓激肽、5-羟色氨等物质引起的毛细血管通透性增加，并通过抑制肥大细胞释放的组织胺等活性物质减少渗出，降低早期血管通透性，故而起到抗炎作用[14]。
NF-κB通路是炎症反应中的经典通路，NF-κB与起抑制作用的蛋白I-κB相结合，在细胞浆中呈无活性状态存在[15]。I-κB的亚型种类繁多，其中I-κBα抑制NF-κB的作用最强，故I-κBα可作为考察指标。当受到外在因子刺激时，IKK被激活，I-κBα在IKK的催化下被磷酸化，致使NF-κB二聚体与I-κBα分离，游离状态的NF-κB p65转位到细胞核后，作用于核内相应的炎性基因，促使靶基因进行转录和表达，引发炎症反应[16]。本研究成功建立LPS诱导巨噬细胞增殖、分泌炎性因子的模型，并在此基础上进行不同方式的干预。结果显示，加入白及胶/微米三七膏含药血清后炎症反应得到了明显的改善。含药血清组细胞浆NF-κB p65蛋白表达量显著增高，细胞核NF-κB p65和细胞浆p-IκBα蛋白表达量显著降低。推测白及胶/微米三七膏含药血清通过NF-κB通路抑制NF-κB p65进入细胞核，下调I-κBα的磷酸化，从而减少巨噬细胞分泌炎性因子来改善LPS诱导的炎症反应。
综上所述，白及胶/微米三七膏含药血清对LPS诱导的细胞炎症损伤模型具有显著的改善作用，这也为防治DFU提供新的理论依据和思路，但由于创面炎症机制复杂，且白及、三七药理作用广泛，其治疗DFU的具体作用机制是否存在多通路及多靶点目前尚不明确，值得进一步探究。
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