陈志磊1 安凤杨1 刘笑宇2 刘 欢2 郭云然2 于海琦2
1 河北大学临床医学院 河北省保定市 071000 2 河北大学基础医学院 河北省保定市 071000
【摘 要】目的：分析与探讨燃煤型砷中毒患者中抑癌基因p16 突变与甲基化的情况及意义。方法：选取120 例2013 年4 月-2015 年5 月在我院收治的燃煤型砷中毒患者，依照皮肤病变病理学诊断结果，将所有患者分为癌前组（24 例）、癌病组（20 例）及普通病变组（76 例），通过PCR 与 PCR-SSCP 产物克隆测序检测突变热点显子，并通过甲基化内切酶分析第1 外显子。结果：通过PCR 与PCR-SSCR 产物克隆测序对燃煤型砷中毒病人外周血DNA 进行分析，没有检测出抗癌基因p16 第2 外显子发生突变。通过SmaI 酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA 后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16 第1 外显子片段4 例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI 位点甲基化情况。结论：研究表明，p16 基因由于高度甲基化是造成p16 基因在砷性肿瘤中失活的关键方式，而且在砷致癌中发挥着重要作用。
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关键词 抑癌基因p16；燃煤型砷中毒；突变；甲基化
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取120 例2013 年4 月~2015 年5 月在我院收治的燃煤型砷中毒患者，其中92例男性，28 例女性，年龄为19~60 岁，平均年龄为（47.2±4.5）岁。依照皮肤病变病理学诊断结果，将所有患者分为癌前组（24例）、癌病组（20 例）及普通病变组（76例）。三组患者临床资料差异性不明显，P>0.05，不具有可比性。
1.2 仪器与试剂
所用试剂为dNTP、Taq DNA 聚合酶、内切酶 SmaI 以及电泳用琼脂糖，以上试剂均为上海TaKaRa 公司提供。所选仪器为全自动紫外分光光度计、电泳仪等。
1.3 提取DNA
空腹采取患者2ml 静脉血， 并行EDTAK2 抗凝，采用酚氯仿法对基因组患者DNA 进行抽提，紫外分光光度计实施定量，将其稀释到大约100ng/ul，在-20℃环境下保存。
1.4 PCR-SSCP
通常p16 基因点在第2 外显子发生，而且由于第2 外显子相对比较大，通过两对引物实施扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定后，去PCR 产物5ul，再加入SSCP 缓冲液（5ul）混匀。
1.5 甲基化分析
通过内切酶SmaI 实施DNA 酶切，并在30℃环境下进行16h 的消化，65℃环境下灭活大约20min, 将消化完成的DNA 当作模板，并对p16 基因第一外显子进行扩增，CG 甲基化将这种酶切作用阻断，若DNA 通过SmaI 消化后依旧可以向第一外显子扩增，表示这种基因SmaI 位点甲基化。
1.6 统计学处理
采用spss16.0 软件进行统计学处理，X2 检验数据分析，P<0.05 表示差异性比较明显，具有统计学意义。
2 结果
2.1 抗癌基因p16 第2 外显子突变检测结果通过PCR 与PCR-SSCR 产物克隆测序对燃煤型砷中毒病人外周血DNA 进行分析，没有检测出抗癌基因p16 第2 外显子发生突变。
2.2 分析抗癌基因p16 第1 外显子甲基化结果
通过SmaI 酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA 后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16 第1 外显子片段4 例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI 位点甲基化情况，见表1。
3 讨论
抑癌基因p16 是近年来所研制的一种在细胞分裂中直接作用的一种基因，抑癌基因p16 主要参与肿瘤病变发生及发展，其中的抑制细胞p16和视网膜细胞瘤基因、p53 基因、细胞周期素依赖性集美以及细胞周期素等组成周期细胞反馈调节环，对人体细胞周期具有调控作用。本研究通过PCR、PCR-SSCP 产物克隆测序检测突变热点显子，没有检测出突变现象。并通过甲基化内切酶分析第1 外显子，研究结果发现，通过SmaI 酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA 后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16 第1 外显子片段4 例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI 位点甲基化情况。砷是一种致癌物质，在生物机体与外在环境中均存在甲基化代谢转换过程，采用甲基化的方式降低砷的毒性，然而，因为砷转化途径类似于DNA甲基化，很可能会导致抑癌基因或者原癌基因甲基化模式发生变化，具有致癌作用，而p16基因由于高度甲基化是造成p16 基因在砷性肿瘤中失活的关键方式，而且在砷致癌中发挥着重要作用。
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参考文献
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