杜楚玲 杜憬生 邵长丽 蔡宇 黄志海
【摘要】目的建立高效液相色谱法测定北豆根中蝙蝠葛碱含量。方法色谱条件：C18柱为填充剂，乙腈∶水∶三乙胺=45∶55∶0.1（体积分数）为流动相，检测波长为284 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。结果蝙蝠葛碱在0.4~2.0 ug范围内有效，进样量与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 5）；稳定性试验、精密度实验、重复性试验的RSD值均小于2%；蝙蝠葛碱的平均回收率为100.30%，RSD%=1.000%。结论该高效液相色谱法方法灵敏、准确度、精密度、重现性好，操作简便，可作为蝙蝠葛碱含量的检测方法。
【关键词】北豆根 蝙蝠葛碱 高效液相色谱法
doi：10.3969/j.issn.1671-332X.2014.09.030
北豆根为防己科植物蝙蝠葛（Menispermum Dauricum DC.）的干燥根茎，是一种常用的中药，具清热解毒、祛风止痛之功效，主要用于治疗咽喉肿痛、肠炎痢疾、风湿痹痛［1］。北豆根的应用越来越广泛，需求量也在不断的增加，而北豆根中含有丰富的蝙蝠葛碱，蝙蝠葛碱是北豆根的主要有效成分之一，但是对于不同产地或不同批次，北豆根中蝙蝠葛碱的含量都是不一样的，所以必须建立方便、有效的高效液相色谱法对北豆根进行检测［2］，检测北豆根所含有的蝙蝠葛碱的含量，为临床合理地应用北豆根提供了理论的依据，使蝙蝠葛碱更加合理、有效地应用在疾病的治疗上。
1仪器与试剂
1.1仪器
日本岛津高效液相色谱仪；宁波新芝生物科技股份有限公司超声波清洗器（型号SB5200D）；广州研创生物技术发展有限公司C18柱（250×4.6 mm）；津腾溶剂微孔过滤膜（有机膜0.45 um）；上海奥豪斯仪器有限公司电子天平（型号CP124）。
1.2试剂与药品
瑞典欧森巴克环境化学公司乙腈（GR，4L）；天津市科密欧化学试剂有限公司三乙胺（GR）；天津市科密欧化学试剂有限公司甲醇（HPLC专用）；华润怡宝食品饮料有限公司怡宝纯净水；蝙蝠葛碱标准品（广州市药品检验所）；康美药业股份有限公司北豆根（批号120904741）。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：C18柱（广州研创生物技术发展有限公司，250×4.6 mm）；流动相：乙腈-水-三乙胺 （45∶55∶0.1）；检测波长：284 nm；柱温：30℃；流速为1.0 ml/min［3-4］。
2.2对照品溶液的制备
取置于五氧化二磷干燥器中干燥12 h的蝙蝠葛碱标准品精密称0.005 0 g，置于10 ml容量瓶中，用纯乙腈定容；后精密量取2 ml置于10 ml容量瓶中用纯乙腈定容，即得0.1 mg/ml的蝙蝠葛碱标准品溶液。
2.3供试品溶液的制备
将北豆根样品粉碎，取本品粉末（过三号筛）精密称定约0.200 0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过膜，即得［5］。
2.4标准曲线绘制
精密吸取蝙蝠葛碱对照品溶液4，8，12，16，20 ul进样，记录所得色谱峰面积，以峰面积（A）为纵坐标，质量（C）为横坐标，绘制标准曲线，进行回归，所得回归方程：y=895 296x-113 056。结果表明，蝙蝠葛碱在0.4~2.0 ug范围内线性关系良好（r=0.999 5，n=5）。见图1、图2。
2.5方法学考察
2.5.1精密度试验
精密吸取蝙蝠葛碱对照品溶液各20 ul，连续进样5次，记录各色谱峰的峰面积，计算得到蝙蝠葛碱对照品的RSD%=1.977%，表明本试验方法精密度良好。
2.5.2穏定性试验
精密称取批号为120904741的北豆根药材约0.200 0 g，按照“2.3”项下制备方法制备供试液，精密吸取供试液20 ul，进样5次，时间间隔为0、2、4、8、12、24 h，测定并记录蝙蝠葛碱的峰面积，结果RSD%=1.849%，表明在24 h内测定结果穏定。
2.5.3重复性试验
精密称取同一批号的北豆根药材粉末（过三号筛）约0.200 0 g，按照“2.3”项下制备方法制备供试液，精密吸取供试液20 ul，重复平行测定5次，记录色谱峰，计算得到RSD%=1.240%，表明本试验方法重现性良好。
图1蝙蝠葛碱色谱图
图2标准曲线图
2.5.4加样回收率试验
取北豆根药材粉末6份，精密称定每份约0.100 0 g，于每份样品中加入适量蝙蝠葛碱对照品
溶液，按“2.3”项下制备方法制备供试液，精密吸取供试液进样分析，计算回收率，得到平均回收率为100.30%，RSD%=1.000%，表明本实验回收率良好［6］。
3讨论
本实验参考相关文献对北豆根的流动相进行筛选，使用有不同比例磷酸水与乙腈，但是蝙蝠葛碱的保留时间与其溶剂的保留时间有重叠，两个峰无法分开，所以使用含有三乙胺和乙腈的流动相，试验了流动相为乙腈-0.05%三乙胺溶液∶45∶55，得到的谱图良好，但保留时间在32 min左右，时间稍长，最后综合保留时间和谱图的形状，选择流动相为乙腈-水-三乙胺 （45∶55∶0.1），该流动相得到的谱图形状对称，峰形良好，保留时间适合。
本实验对北豆根的提取方式进行了探究，用索氏提取法提取3 h［3］，得到的北豆根含量为0.42%，用超声提取法提取30 min［4］，得到的北豆根含量为0.55%，且该法操作简单，用时较短，所以实验采取超声提取法提取北豆根。
本实验通过对HPLC测定蝙蝠葛碱的流动相的筛选，对北豆根提取方法的考察，确定合适的色谱条件，并且进行了方法学考察，方法学考察符合规定，表明该高效液相色谱法方法灵敏、准确度、精密度、重现性好，操作简便，可作为蝙蝠葛碱含量的检测方法。
［1］王栋，王楠，刘岩，等.HPLC法测定北豆根总碱粉针剂中蝙蝠葛碱含量［J］.中医药学报，2006，34（1）：8-9.
［2］江万焯.HPLC法测定人血浆中莫西沙星的浓度［J］.现代医院，2012（12）：50-55.
［3］刘威.中药材北豆根的质量与应用研究［D］.辽宁：辽宁中医药大学，2006：6.
［4］刘威，张振秋，洪涛，等.HPLC法测定北豆根中蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的含量［J］.中药材，2005，28（9）：783-784.
［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：104-105.
［6］夏崇才，高运军，方明治，等. 高效液相色谱法测定癌痛宁巴布剂中乌头碱的含量［J］.中国医药导报，2013，10（31）：112-114.