袁琦 张征 胡小宣
湖南省人民医院肝病内科，湖南长沙410005
[摘要]目的研究姜黄素体外对人结肠癌Lovo细胞血管内皮生长因子VEGF表达的影响。方法不同浓度（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）姜黄素处理2013年8月—2014年2月中南大学提供的人结肠癌细胞株Lovo24h后，用Real-timePCR检测姜黄素对人结肠癌细胞株血管内皮生长因子VEGFmRNA表达的变化，用Westernblot法检测姜黄素对人结肠癌细胞株VEGF蛋白表达的变化。结果人结肠癌Lovo细胞经过姜黄素处理24h后，5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L姜黄素组VEGFmRNA及蛋白的表达均明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论姜黄素能下调人结肠癌Lovo细胞VEGF的表达，并呈剂量依赖，这可能是姜黄素抑制结肠癌Lovo细胞增殖及侵袭性的机制之一。
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关键词 姜黄素；结肠癌；血管内皮生长因子
[中图分类号]R587.1[文献标识码]A[文章编号]1674-074２（２０１4）12（b）－０035-03
[作者简介]袁琦（1983.1-），女，湖南邵东人，医学硕士，医师，研究方向：消化道肿瘤。
姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用，且毒性低，具有良好的临床应用潜力，尤其是其抗肿瘤作用受到国内外广泛关注。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来以手术、化疗、放疗、免疫等的综合治疗手段取得了一定的进展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制着化疗药物和免疫制剂等的应用和疗效。有研究表明，姜黄素能显著抑制结肠癌HCT-116细胞的生长[1]，姜黄素能显著抑制人结肠癌Lovo细胞的增殖并促进其凋亡[2]，研究证实在肿瘤的侵袭、转移过程中，血管内皮生长因子（VEGF）起到了极其重要的作用[3]。该实验以2013年8月—2014年2月中南大学提供的结肠癌Lovo细胞作为研究对象，观察了不同浓度姜黄素对结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响，以求从多角度对姜黄素对结肠癌细胞的作用进行研究，对结肠癌临床治疗提供有益的理论依据，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
人结肠癌Lovo细胞由中南大学肿瘤研究所提供；姜黄素购自Sigma公司，称取3.684mg的原料药充分溶解于1mLDMSO中，得到终浓度为10mmol/L的母液，临用时用完全细胞培养液稀释到所需浓度。Trizol、逆转录试剂盒购自大连宝生物公司，引物由大连宝生物公司合成。蛋白提取液及ECL发光试剂盒购自Pierce公司，兔抗人VEGF多克隆抗体及羊抗兔二抗lgG购自SantaCruz公司。
1.2细胞的培养及处理
人结肠癌Lovo细胞接种于含10%胎牛血清1640培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的Lovo细胞，实验分组为对照组（姜黄素0μmol/L，加入等量DMSO），姜黄素5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L组，处理后再置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24h。
1.3Real-timePCR
采用Trizo1试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，计算OD260/280，比值在1.8~2.0的RNA标本用于反转录。总RNA按说明书进行逆转录反应合成cDNA，逆转录产物cDNA用于Real-time-PCR扩增。VEGF引物：5´端：5´-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3´及3´端：5´-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3´，变性、退火温度为94℃与72℃，40个循环。利用标准曲线，根据样品CT值计算出样品中所含的模板量。
1.4WesternBlot
用蛋白提取液提取细胞蛋白，BCA测总蛋白质浓度。蛋白样品用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上样量为20μg。5%脱脂奶粉TBS缓冲液封闭，4℃过夜，加兔抗人VEGF多克隆抗体（1：500）室温2h，洗膜30min，加入羊抗兔二抗（1：1000）室温结合1h，ECL显色，内参采用β-actin。采用Image-ProPlus6.0图像分析软件对蛋白条带进行灰度分析。以VEGF条带与内参β-actin条带的灰度比值代表VEGF蛋白的表达水平。
1.5统计方法
实验所得计量数据以（x±s）表示，采用spss13.0软件进行方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGFmRNA表达的影响
利用Primer3.0软件分别设计出扩增人VEGF和GAPDHmRNA的引物，Real-timePCR检测VEGFmRNA的表达，见表1，并用EXCEL做出各组VEGFmRNA相对表达量柱状图表达，见图1，姜黄素5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L组与对照组相比，VEGFmRNA的表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈剂量依赖性。
2.2不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF蛋白表达的影响
不同剂量姜黄素处理Lovo细胞，收集细胞总蛋白，用WesternBlot检测VEGF蛋白的表达（结果见图2），并用Image-ProPlus6.0对图像进行灰度分析（结果见表1，图3），姜黄素5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L组与对照组相比VEGF蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈剂量依赖性。
3讨论
血管内皮生长因子VEGF随着肿瘤增殖、侵袭和转移而表达明显升高[4]。VEGF信号还与肿瘤细胞的淋巴管、淋巴结侵袭及远端转移密切相关[5]。梁启廉等研究发现VEGF表达水平与大肠癌组织学分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关[6]。且临床观察发现大肠癌患者术前血清VEGF水平与大肠癌的浸润、转移密切相关[7]。有研究者利用同源重组将结肠肠癌细胞系中VEGF-A敲除后发现，当细胞缺失了VEGF信号后，细胞的生长受到了明显的抑制，且细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性增强[8]，而在临床上仅仅通过阻断细胞表面的VEGF受体来治疗结直肠癌效果是有限的。
目前研究发现，姜黄素能够对消化系肿瘤有很好的抑制作用，其药理活性主要表现在能够下调核转录因子（NF-kB）的活性，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，抑制血管生成[9]。在人结肠癌HCT116细胞中，姜黄素可有效抑制结肠腺癌细胞集落生长和侵袭能力[10]。不同浓度姜黄素作用人结肠癌SW620细胞24h，增殖抑制显著[11]。
该研究用4种不同浓度的姜黄素分别作用Lovo细胞24h后，利用Real-timePCR及WesternBlot方法检测VEGF的mRNA及蛋白的表达，发现各姜黄素组（5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）与对照组比较，VEGF的mRNA及蛋白的表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且姜黄素的作用浓度越高，VEGF的表达量越低，该作用呈剂量依赖，提示姜黄素能通过抑制人结肠癌细胞Lovo中VEGF的表达来抗结肠癌血管形成，抑制结肠癌细胞的生长和转移。此结果与贾佳等的观点一致，他们发现姜黄素能够下调结肠癌细胞HT-29中β-catenin、VEGF的表达[12]。在多个结肠癌细胞系中，均有研究证实姜黄素能下调VEGF的表达，进一步可利用建立的结肠癌裸鼠移植瘤模型，从体内水平研究姜黄素能否下调瘤组织VEGF的表达，且姜黄素是否通过NF-KB信通路来下调人结肠癌细胞VEGF的表达，该机制也有待进一步研究。VEGF是抗癌药物治疗的新靶点，姜黄素作用后的人结肠癌Lovo细胞VEGF水平下降，提示姜黄素可能通过下调VEGF的表达抑制了VEGF促进肿瘤新生血管的作用，从而抑制了结肠癌的增殖和转移。该研究为姜黄素的临床应用提供新的理论依据。
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参考文献
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（收稿日期：2014-09-16）