于宗光
山东省即墨市第二人民医院神经外科，山东即墨 266214
[摘要] 目的 探讨大黄汤剂蒽醌类成分测定方法及其在颅脑损伤中的应用。方法 通过使用超高效液相色谱方法对大黄汤剂中的蒽醌类药物成分进行测定。选取我院70例创伤性颅脑损伤患者在通过鼻饲大黄汤剂后实施腰椎穿刺手术，采用以上方法对患者的脑脊液进行检测。然后把检测出的蒽醌类成分在动物中进行实验，使用20只实验鼠进行对比治疗。实验鼠分为治疗组和对照组，治疗组实验鼠给予大黄素甲醚灌胃，对照组给予生理盐水灌胃。灌胃24 h后取上实验鼠脑皮质，通过经胺法检测大鼠脑皮质SOD活力。结果 70例创伤颅脑损伤病人鼻饲大黄汤剂后脑脊液中有大黄有效蒽醌类成分为大黄素甲醚。通过动物对该成分进行实验中发现两组大鼠的SOD活力有显著差异，治疗组大鼠脑皮质的SOD活力要明显高于对照组（t=5.640,P=0.012）。结论 大黄汤剂中的大黄素甲醚可能为大黄抗颅脑损伤的有效成分，且能够提高颅脑损伤大鼠脑组织中的SOD活力。
[教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ] 大黄汤剂；蒽醌类成分；颅脑损伤
[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）09（b）-0191-02
大黄属于科类植物，其中包含了蒽醌类以及苯丁酮类等成分，在临床使用中具有抗菌、消炎等功效。临床多采用大黄用于中药制剂中。关于大黄蒽醌类成分的测定临床上采用的方法也比较多，诸如比色法、高效液相法以及毛细管电脉法等等。大黄具有的活血化瘀以及泄热等功效是治疗颅脑损伤的一个综合应用。因而，大黄以及大黄中的有效成分是治疗颅脑损伤的药效学指标[1]。
颅脑损伤是指头部在受到外力而导致的损伤[2]。颅脑损伤在中青年中的致死和致残率十分高，对于严重者的治疗通常是以防治全脑缺血为主。在治疗颅脑损伤的过程中，通过降低颅内压以及改善脑血流是治疗的主要机制。当前，对颅脑损伤较为有效的治疗还处于实验室阶段，临床上对此类疾病的治疗研究并不理想。从中医的角度来说，颅脑损伤导致的昏迷的病机是外伤致使闹脉络破裂，血溢出脉外导致积而成淤而致使患者昏迷不醒。
本次研究通过对大黄汤剂中的蒽醌类成分进行测定，探索其在颅脑损伤中的应用，并分析其抗氧化药理功效[1]。确定可吸收的作用于颅脑中的有效成分，为提高中药质量研究提供参考，现报道如下。
1资料与方法
1.1 一般资料
选取我院2013年6月—2014年1月收取的70例创伤性颅脑损伤患者在通过鼻饲大黄汤剂后实施腰椎穿刺手术，采用以上方法对患者的脑脊液进行检测。70例颅脑损伤患者有不同程度的损伤，患者年龄在20~45岁之间，其中有男性患者39例，女性患者31例。
然后把检测出的蒽醌类成分在动物中进行实验，使用20只实验鼠进行对比治疗。实验鼠分为治疗组和对照组，治疗组实验鼠给予大黄素甲醚灌胃，对照组给予生理盐水灌胃[2]。灌胃24 h后取上实验鼠脑皮质，通过经胺法检测大鼠脑皮质SOD活力。
1.2 方法
1.2.1大黄汤剂蒽醌类成分测定 材料与仪器：使用美国某公司生产的Waters Acquity高效液相色谱仪器。仪器构成为二元泵处理器、柱温箱以及样品处理器等；生大黄：于中药房购买生大黄，样品存于药理实验室[3]。
色谱条件：色谱柱为2.0×100mm,1.6um，色谱柱温控制在四十摄氏度，探测波长控制在255纳米，进样量为4uL[4]。
试品溶液的制备：为了确保定量的准确性，通过量杯进行定量，取30 g的生大黄，处理干净后研磨成粉末在蒸馏水中浸泡半个小时，然后煎煮沸腾20 min。待其冷却之后加以过滤，文火上浓缩成含有大黄生药的药液。
对照品溶液的制备：精密称定适量的番泻苷A、B，芦荟大黄素、大黄素等，使用甲醇溶解定容到30 mL的瓶中进行数分钟的摇匀。摇匀后可得一定浓度的溶液，分别取溶液对照品放入20 mL的瓶中，并且加入些许甲醇进行稀释到刻度。
标准曲线的制备：精密吸取一定量的对照溶液，同时加入甲醇进行稀释制成标准品溶液，根据以上的色谱条件对各样3uL测定。
1.2.2 实验鼠大黄素甲醚抗氧测定 材料与仪器：取SOD试剂盒，常州万泰有限公司的电子分析天平，北京优尼康生物公司的微量匀浆仪[5]。
试验方法：20只大鼠，雌雄大鼠分别10只，大鼠年龄为3~5个月，重量为260~320 g。两组大鼠经过麻醉后俯卧于手术台，对其左脑进行开颅手术，在前臼后侧的1.5 mm，左侧2 mm处开骨窗，直径为0.6里面。使用重锤对骨窗进行自由落体的冲击，冲击力控制在1000g.cm，然后使用骨蜡封闭大鼠骨窗。大鼠苏醒后对对照组进行生理盐水灌胃，治疗组使用大黄素加密灌胃，灌量保持一致。
脑组织超氧化物测定：灌胃后的24 h在对大鼠麻醉后处死，取大鼠头部进行清洗，去除血液使用滤纸拭干并且进行称重，取200 mg的脑皮层组织当放入2 mL的匀浆介质中，然后使用匀浆器进行匀浆，取上清液测定器SOD活性。
1.3 纳入标准
对颅脑损失患者的纳入标准规定如下：有昏迷史和颅脑外伤史；使用昏迷量表进行测定时评分应该低于8分；年龄处于14~55岁之间；昏迷时间在3~14 d内，且患者的体征正常。排除标准为：具有颅脑原法性疾病的患者；有严重的不可逆性脑干损害；出现严重的合并损伤；入院后1 d后死亡。
1.4 统计学方法
实验计量数据用均数±标准差（x±s）表示,多组间计量资料比较用one—ayANOVA方法分析,两组间计量资料比较采用student—t检验,均采用统计软件spss 15.0处理[6]。
2结果
70例创伤颅脑损伤病人鼻饲大黄汤剂后脑脊液中有大黄有效蒽醌类成分为大黄素甲醚。通过动物对该成分进行实验中发现治疗组大鼠脑皮质的SOD活力要明显高于对照组。
大黄汤剂蒽醌类成分测定结果：大黄汤剂中的各个成分的相关系数都高于0.99，可见其标准曲线性较好；且大黄汤剂中含有蒽醌类成分测定结果的相对标准偏差在3%~5%以内。其中番泻苷B浓度为（4.49±0.20），A浓度为（12.81±0.70），大黄素质量浓度为（9.79±0.30），大黄素甲醚质量浓度为（5.41±0.32）。
实验组测定结果：对照组大鼠脑皮质SOD活力为（19.92±1.07）U/mg Prot,治疗组大鼠脑皮质SOD活力为（22.76±2.83）U/mg Prot,两组大鼠的SOD活力有显著差异，（t=5.640,P=0.012）。
3讨论
通过本次研究确定了创伤颅脑损伤病人鼻饲大黄汤剂后脑脊液中有大黄有效蒽醌类成分为大黄素甲醚，且大黄汤剂中的各个成分的相关系数都高于0.99。且在对两组实验鼠进行对比研究后得出给予大黄素甲醚灌胃的老鼠的大脑皮质的SOD活力要比给予生理盐水灌胃组实验组的大脑皮质的SOD活力要高，两者相差在（5.1±1.75）U/mg Prot左右。研究结果证明了通过采用高效液相色谱方法对大黄汤剂蒽醌类成分进行测定能够检测出颅脑损伤患者的脑脊液中有大黄素甲醚成分，同时也证明了这一种成分具有的抗氧化作用[7]。目前，临床上对大黄汤剂成分的测定研究并不多，而作为临床上患者直接服用的一个药剂，对其的测量是确保其质量符合临床实际的一个关键[8]。王杨进行三组动物实验对比结果得出SD大鼠脑皮质SOD活力在假手术组较模型组显著增高,治疗组较假手术组显著增高，同时对超高效液相色谱方法在对大黄汤剂7种葱酮类成分测定中也发现了创伤性颅脑损伤患者脑脊液中可吸收的有效生物成分。可见，采用超高效液相色谱测定方法测定具有有效性。
通过超高效液相色谱测定方法测定大黄汤剂蒽醌类成分后，在患者的脑脊液中测出了可吸收有效成分的大黄素甲醚，该成分在经过患者的胃肠道后会吸入适量的血，而后通过脑血屏障进入患者的靶器官中。大黄素作为生物活性成分在抗颅脑损伤中具有一定的作用，但是关于其如何发挥功效目前还不清楚。本次研究中从氧化应激方面进行了研究。氧自由基能够诱导出提提的损伤而成为氧化应激，其是脑损伤后的其中一个有害路径。而且脑外伤的严重程度同氧化应激的程度有很大的联系，因为大脑中有很多容易受氧自由基攻击的脂肪酸，因此在出现脑损伤后，脑细胞就会对应激神经变性很敏感。在没有足够的抗氧化剂介入之后，如果活性氧族原色过量就会导致氧化而引起脂质的破坏，进而诱发细胞血管结构出现氧化作用。SOD是机体中的活性物质，能够在机体中起到消除有害物质的作用，而且还能够在降低氧族元素导致的抗颅脑损伤[9]。因而，SOD能够作为治疗颅脑损伤的治疗方法。本文章对大黄素甲醚能够提高大鼠脑皮质中的SOD活力进行的验证，该成分也为大黄可吸收有效成分作为大黄质量控制标准提供了依据。
本次研究得出以下结论：通过超高效液相色谱方法能够测定大黄汤剂只能怪的7种成分，且简单快速；大黄汤剂中的大黄色甲醚是颅脑损伤患者脑脊液中可吸收的成分；大黄素甲醚具有提高SOD活力的作用，能够保护颅脑抗氧化。
总而言之，通过高效液相色谱测定大黄汤剂蒽醌类成分不仅精确而且简单，值得推广。大黄汤剂中的大黄素甲醚可能为大黄抗颅脑损伤的有效成分，且能够提高颅脑损伤大鼠脑组织中的SOD活力，具有抗氧化颅脑的保护功效。
[教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献]
[1] 范荣,黄熙,王杨,等.UPLC法测定脑外伤患者口服大黄吸收入血蒽醌类成分[J].世界科学技术(中医药现代化),2011（4）:676-680.
[2] 王杨,黄熙,梁清华,等.超高效液相色谱法测定脑外伤患者口服大黄后尿液中蒽醌类成分[J].中草药,2010（7）:1103-1106.
[3] 尧爱珉,黄金秋,徐大星,等.RP-HPLC法测定栀子大黄汤中多种成分的含量及其在方剂配伍研究中的应用[J].中国药科大学学报,2013（6）:531-535.
[4] 闫云燕. 蒽醌类活性成分群的中空纤维细胞捕获及超声乳化离子液体微萃取分析[D].山西医科大学,2013（2）:12-14
[5] 王志鹏，刘莉，梅其炳，等.唐古特大黄多糖对大鼠实验性颅脑外伤的保护作用[J].中国中药杂志，2010，28(10)∶974-977.
[6] 黄熙.生物方剂分析中医药学研究的设想、背景与意义[J].中国中西医结合杂志，2008，22(4)∶251-252.
[7] 邓杰,王明明,方国安，等.大黄对脑创伤患者血清细胞因子的早期影响[J].中国临床药学杂志,2010,15(1):50-51.
[8] 盖杰，司建伟，左俊杰.生大黄在重症颅脑损伤中的应用[J].光明中医，2011，22（3）∶30-31.
[9] Je-Hyun Lee, Jong Moon Kim, Chungsook Kim. Pharmacokinetic anal－ysis of rhein in Rheum undulatum L[J].Journal of Ethnopharmacology,2009（84）∶5-9.
(收稿日期：2014-07-28)