王 乐
河北承德护理职业学院 河北省承德市 067000
【摘 要】宏基因组技术不仅在生物催化转化及活性物质筛选过程应用广泛，同时，该项技术在生物降解基因的研究中也具有明显的优势。宏基因组技术的产生为我们研究未知微生物资源指明了方向。宏基因组技术可用于非培养微生物的基因鉴定，尤其是不稳定或异生型化合物生物降解途径所涉及的关键基因。利用宏基因组技术研究微生物降解基因的多样性，主要包括基于序列及非序列的两种分子生物学手段。
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关键词 宏基因组技术；生物降解基因；研究中；应用
宏基因组技术不仅在生物催化转化及活性物质筛选过程应用广泛，同时，该项技术在生物降解基因的研究中也具有明显的优势。目前，研究者已经发现了880 种化合物及中间产物、590 种酶、340 种微生物，并证实了 140 个代谢途径、930 个反应过程等，而这些数据大多数来自过去40年间纯培养技术的研究成果。纯培养技术主要针对少数生长快且具有较强污染物降解能力的微生物，由于其存在一定的局限性，现代微生物学家致力于探索更为有效的方法来研究未知的微生物资源，宏基因组技术的产生为我们研究未知微生物资源指明了方向。宏基因组技术可用于非培养微生物的基因鉴定，尤其是不稳定或异生型化合物生物降解途径所涉及的关键基因。利用宏基因组技术研究微生物降解基因的多样性，主要包括基于序列及非序列的两种分子生物学手段。
1 基于序列的方法检测生物降解基因
通常，代谢酶在其活性中心均具有保守的氨基酸序列，这些序列编码的酶可用于污染物及异生型化合物的生物降解或生物转化。可以利用基于序列相似性的技术来鉴别具有相同或相似反应的酶和基因，进而发现具有更强动力学特性的生物降解酶。例如，利用兼PCR 引物，从含水土层中获得的多组分苯酚羟化酶单加氧酶基因，比其他同类酶具有更强、更持久的三氯乙烯降解能力。
2 基于PCR 技术检测酶的多样性
有研究表明，含有煤焦油的污染水样中的细菌mRNA 经反转录后，用mahAc基因编码的大亚基引物进行PCR 扩增，可以获得萘双加氧酶的多样性。研究发现，在不同生物体中双加氧酶mRNA 的基因序列相差高达21%，这可能是由于不同微生物具有不同的底物范围和专一性酶造成的。
利用实时定量PCR 技术从煤焦油污染的水体沉积物中扩增类似于nahAc 敲的基因序列，结果得到多种类似nahAc 基因的序列，且其丰度与污染源的萘浓度有很大关系。
DNA 指纹技术已被广泛用于复杂群落的系统发育分析，但应用该技术分析降解基因的多样性还处于早期阶段。该技术无需全基因测序，分析代谢基因的指纹图谱就可揭示微生物的底物专一性及酶的降解过程。例如，基于DNA 单链变性凝胶方法测定芳香类化，污染的样品中儿茶酚2，3- 双加氧酶的多样性，结果表明根据污染程度可以分离到不同丰度和多样性的C23O基因。结合统计分析技术，代谢基因的指紋图谱将成为系统研究全基因序列及丰度的有力工具。
3 荧光原位杂交标记生物降解基因
荧光原位杂交技术（FISH）是通过荧光标记的RNA 探针对已固定的细胞进行原位杂交，从而使转录过程可视化，该技术广泛应用于微生物鉴定等方面。目前，广泛选择无辐射的地高辛尿嘧啶三磷酸进行标记，用于高特异性抗体的检测。而基于酪胺信号放大的FISH 技术增强了荧光标记酪胺的杂交信号。
利用基于序列的分子生物学方法我们检测到了许多降解基因，但由于一个反应往往是由多种酶共同催化完成的，基因保守序列的相似性并不能保证具有相同的功能。因此，利用保守基因序列的相似性来鉴别生物降解酶仅仅是研究的一个方面。
4 基于非序列的方法检测生物降解基因
4.1 差异显示
mRNA 差异显示法（DD） 是一种根据特定条件下的诱导表达来鉴定基因的非序列检测法，来自不同生长条件的细胞mRNA 经过用PT-PCR 扩增就可被区分开来。DD 是一门新兴的微生物学技术，但当其应用于揭示环境样品的相关序列时仍具有局限性。这是因为细菌的mRNA 不像真核细胞那样容易发生poly（A）到poly（dT）的反转录。目前，DD 技术已被用于检测Rhodococcus erythropolis HLPM-1中有关2，4- 冬硝基酚降解操纵子基因以及检测混合培养基中的环己酮单加氧酶基因。此外，在经甲苯诱导的土壤样品中，利用DD技术发现了一种新型的基因序列。尽管DD 技术需要分析大量的PT-PCR 检测反应并排除假阳性，但它尽可能地为基因表达研究提供了一种非培养且不依赖于任何基因序列的有力方法。
4.2 稳定性同位素标记
Meselson 和Stahl 利用将原子结合到DNA 可增加DNA 的密度从而使复制后的父母与后代分离的原理，提出了DNA 半保留复制假说。稳定性同位素标记（SIP）即应用这一观点在化合物中纳入重原子，进而从分解代谢该标记化合物的活性微生物中分离出核苷酸。通过纳入大量的稳定同位素原子，造成标记与未标记样品间的密度差异，利用密度梯度离心分离出含130 核苷酸的微生物基因组。该分离得到的标记核苷酸可以用于构建宏基因文库或作为PCR 或PT-PCR 的反应模板。SIP 的主要特点是能够直接进入活性生物体的核酸中，无需事先了解这些微生物在样品中的存在性及丰度。另一种方法是使用溴脱氧尿苷（BrdU）来标记，其优点在于能代谢BrdU 的微生物的DNA 可以与BrdU 共沉淀。
应用于环境生物学的各种新技术已越来越多地被用于揭示与生物降解和生物转化相关的序列，以及其在自然环境中保持活性的条件。分析具有污染物代谢活性的群落的系统发育关系变得越来越重要，因为系统发育的微小变化都会引起生物降解特异性的改变。无论是对宏基因组进行大规模的测序，还是利用宏基因组技术寻找具有生物降解潜能的基因，都将与纯培养技术联手共同开发生物降解功能的详细信息，从而为工业化社会的持续发展开辟新的途径。