肖美群 刘伟信 张 勇
东莞三局医院外三科，广东东莞 523710
[摘要]目的 研究植物雌激素对糖尿病大鼠周围神经病变的影响，探讨植物雌激素治疗糖尿病周围神经病变的可行性及疗效。方法 ①建立大鼠动物模型。②药物干预：植物雌激素治疗组、阴性对照组、糖尿病组分别给予金雀异黄素、神经营养因子、生理盐水肌注。③标本取材与制备：取大鼠胫神经切片光镜和电镜下观察。④图像分析：光镜切片得到有髓纤维的髓鞘和轴突面积，神经内外膜的血管数。电镜切片观察有髓神经纤维和神经营养血管内皮的改变。结果 糖尿病组胫神经的有髓神经纤维和神经营养血管组织形态学出现明显变化、阴性对照组正常，植物雌激素治疗组有轻微变化。结论 植物雌激素治疗糖尿病周围神经病变是可行和有疗效的。
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关键词 植物雌激素；糖尿病；周围神经病变
[中图分类号]R587.2[文献标识码]A [文章编号]1674-0742（2015）03（c）-0011-02
Experimental Study of the Effect of Phytoestrogen on Diabetic Limb Ischemic Peripheral Neuropathy
XIAO Meiqun LIU Weixin ZHANG Yong
The Third Department of Surgery， Dongguan Sanju Hospital， Dongguan， Guangdong Province， 523710， China
[Abstract] Objective To study the effect of phytoestrogen on diabetic peripheral neuropathy in rats， and investigate the feasibility and effect of phytoestrogen in the treatment of diabetic peripheral neuropathy. Methods①A rat animal model was established②Drug intervention： Phytoestrogen treatment group， negative control group， diabetes group was treated with intramuscular injection of genistein， neurotrophic factor， physiological saline， respectively.③Sample collection and preparation： Rat tibial nerve sections were collected and observed under light microscope and electron microscope.④Image analysis： Light microscopic sections obtained by myelinated fiber myelin and axon area， the number of inner and outer membrane of vascular nerve. The observation under electron microscope showed that there were changes in myelinated fibers and nerve nutritional vascular endothelium.⑤Statistical analysis： Morphological index of the image was analyzed statistically by variance analysis. Results The myelinated fibers and nerve nutritional vascular histomorphology of tibial nerve in the diabetic group appeared obvious changes， while those of the negative control group were normal， those of phytoestrogen treatment group had a slight change. Conclusion Phytoestrogen is feasible and effective in the treatment of diabetic peripheral neuropathy.
[Key words] Phytoestrogen；Diabetic；Peripheral neuropathy
[作者简介]肖美群（1962.11-），男，江西人，副主任医师，研究方向：糖尿病肢体缺血性神经病变。
该研究探讨植物雌激素治疗糖尿病周围神经病变的可行性及疗效，并从中进一步寻找植物雌激素更好地应用于临床的方向。该科和广东省人民医院整形创伤血管外科合作于2012年5月—2014年3月做了如下研究。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 动物模型的建立
（SD）雌性大鼠（200~250 g）禁食一夜后单次腹腔内注射硫脲佐霉素60 mg/kg，1周后观测鼠尾血糖≥16.7 mmol/L者入选，每2周复查血糖，<16.7 mmol/L的被排除。在模型建立后２周随机选取20只模型大鼠双后肢胫神经及10只正常雌性大鼠双后肢胫神经行组织形态学观察对比，建立模型。
1.2 药物干预
按照随机的原则对成功建立模型动物分为糖尿病组、阴性对照组和植物雌激素治疗组，再分别分为2个月、4个月组亚组，每个亚组10只。植物雌激素治疗组采用金雀异黄素（0.5 mg/kg体重）在造模后２周开始肌注，连续2或4个月。阴性对照组给予神经生长因子（800 u/kg体重）肌注。糖尿病组给予生理盐水肌注。
1.3 标本取材与制备
糖尿病大鼠饲养2、4个月后，应用戊巴比妥（50 mg/kg）深度麻醉后，用4％多聚甲醛灌流固定，取大鼠双后肢胫神经在相同的固定液中固定48 h，然后应用磷酸缓冲液冲洗，在锇酸中固定，用乙醇脱水，Epon812包埋，半薄切片（厚１um）捞至玻璃片上，用甲苯胺蓝染色，光镜下观察。然后超薄切片（厚度50~70 nm）、醋酸铀染色，标本置于透射电镜下观察。
1.4 图像分析
光镜切片采用图像分析仪对图像进行分析，每个标本随机采集５张图像，每个图像随机选定10个有髓神经纤维进行测量，得到有髓纤维的髓鞘面积和轴突面积（um2），以及神经外膜和内膜的血管数。图像分析结果显示：与正常对照组相比，糖尿病模型神经纤维平均截面积略增大、有髓鞘神经纤维密度减少，轴索平均周长较正常组增大、神经外膜和内膜的血管数减少（P<0.01）。
电镜切片观察有髓神经纤维和神经营养血管内皮的改变。糖尿病模型组可见有髓鞘神经纤维板层分离，呈严重脱髓鞘现象，轴突内微丝微管排列紊乱。雪旺氏细胞核呈不规则形，胞质内粗面内质网扩张，线粒体呈空泡样改变，雪旺氏细胞基膜断裂。阴性对照组和植物雌激素治疗组：髓鞘无崩解、变性；轴突线粒体无肿胀，微管、微丝无消失，神经营养血管内皮细胞无水肿，细胞间连接无断裂，线粒体无肿胀。
1.5 统计方法
采用spss 13.00软件包进行数据统计处理，计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，计量数据对比应用t检验，计数数据应用c2检验。
2 结果
糖尿病模型组与阴性对照组和植物雌激素治疗组相比，糖尿病模型神经纤维平均截面积略增大、有髓鞘神经纤维密度减少，轴索平均周长较正常组增大（P<0.01）。见表1。糖尿病模型组与阴性对照组和植物雌激素治疗组相比， 神经外膜和内膜的血管数减少（P<0.01）。见表2。
3 讨论
植物雌激素主要分为异黄酮、木酚素以及香豆素三大种类。其中异黄酮一般大量存在于黄豆或黄豆制品汇总，木酚素存在于蔬菜或谷物中，香豆素一般存在于发芽的豆类中。糖尿病血管病变包括微血管病变和大血管病变，是糖尿病慢性并发症的病理基础和核心环节。组织病理学研究显示糖尿病微血管病变表现为毛细血管基底膜增厚，内皮细胞增生，管腔狭窄，神经外膜血管硬化及舒张功能障碍等。相关报道研究证实，植物雌激素能够对胰岛素分泌与作用产生影响，能够有效改善胰岛素敏感性、调整胰岛素受体结合能力以及缓解氧化应激。
该次3组研究结果显示，糖尿病组胫神经的有髓神经纤维和神经营养血管组织形态学出现明显变化、阴性对照组正常，植物雌激素治疗组有轻微变化。糖尿病模型组、植物雌激素治疗组与阴性对照组的有髓神经纤维髓鞘面积和轴突面积平均值分别为394、370、363 um2；糖尿病模型组、植物雌激素治疗组与阴性对照组的有髓神经纤维神经外膜和内膜的血管总数分别为6、21、35。糖尿病模型神经纤维平均截面积略增大、有髓鞘神经纤维密度减少，轴索平均周长较正常组增大（P<0.01）。表２糖尿病模型组与阴性对照组和植物雌激素治疗组相比， 神经外膜和内膜的血管数减少（P<0.01）。该结果证明雌激素能促进内皮细胞生长，改善内皮细胞功能，延缓动脉粥样硬化的发生发展；可诱导内皮生长因子的合成增加而促进内皮的愈合；还可提供持续的、低水平的抗氧化活性，对内皮细胞有保护作用。在动物糖尿病试验中有证据显示，神经组织会出现氧化应激增加及抗氧化剂保护酶活性受损。雌激素刺激前列环素的合成和释放，从而抑制血小板聚集，改善膜的黏滞性，改善血液流变学。但对于植物雌激素在周围神经尤其是缺血性周围神经病变的作用有待进一步深化研究。众多临床试验报道仅为短期观察性试验，样本容量较小，对其潜在不良反应了解不够深刻。当前植物雌激素对糖尿病肢体缺血性周围神经病变的安全性与有效性还有待长期对照研究。
目前研究证实雌激素具有心血管系统的保护作用，对微循环的改善作用及对神经元及神经纤维的损伤的修复作用，降血糖作用。应用植物雌激素修复受损的神经可能是对糖尿病足的治疗的新方法。
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（收稿日期：2014-12-20）