摘 要：目的 基于白桦脂醇的热力学性质，探讨白桦脂醇新晶型及确定稳定性好、溶解性高的优势药用晶型。方法 对白桦脂醇晶A型热分析的特征图谱进行分析，发现白桦脂醇3种新晶型，采用差示扫描量热法(DSC)、热重法(TG)、粉末X射线衍射法(PXRD)对晶型进行结构表征。采用PXRD进行稳定性评价，采用高效液相色谱法(HPLC)考察晶型的溶解性能。结果 利用相变温度发现了白桦脂醇的3种新晶型，分别为晶B型、晶C型和晶D型。通过稳定性和溶解度评价确定了其优势药用晶型为晶D型(无定型),其在0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中溶解性最好，且在高温[(60±1)℃]、高湿[(90±5)%,25℃]和光照[(4500±500) lx, 25℃]条件下稳定。结论 相比于多晶型研究常用的筛选方法，该研究发现白桦脂醇不同晶型之间的相变规律，为白桦脂醇多晶型的发现和深入研究提供了参考方法，具有简便、快捷的优点。
关键词:白桦脂醇;多晶型;热分析;表征;优势药物晶型;
Discovery and Characterization of Betulin Polymorphs Based on Thermal Analysis
Technology
LIU Qiwen CHEN Ting AN Qi YANG Shiying
YANG Dezhi LYU Yang
DU Guanhua
Bejing Key Laboratory of Polymorphs Drugs Research,Institute of Materia Medica,Chinese
Academy of Medical sciences and Peking Union Medical College Beijing Key Laboratory of Drug
Target and Screening Research,Istitute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College
Abstract：
Objective Based on the thermodynamic properties of betulin, new crystal forms of betulin were discovered and crystal form of dominant drug with good stability and improved solubility was determined. Methods Three new crystal forms of betulin were found by analyzing the characteristic profiles of the thermal analysis of betulin form A.The crystalline forms were characterized through differential scanning calorimetry(DSC),thermogravimetry(TG),and powder X-ray diffraction(PXRD).PXRD was used to evaluate the stability, and high performance liquid chromatography(HPLC) was used to investigate the solubility properties of the crystal forms. Results Three new crystal forms combined with phase change temperatures, namely form B,form C and form D were discovered.The dominant drug crystal form of Betulin was determined to be form D(amorphous) by stability and solubility evaluation, which was best soluble in 0.5% sodium dodecyl sulfate(SDS) solution and stable at high temperature[(60±1) ℃],high humidity[(90±5)%,25 ℃]and light[(4500±500) lx, 25 ℃] conditions. Conclusion Compared with the conventional screening methods in polymorphic research, this study finds the law of phase transitions between different crystal forms of betulin, which provides a reference method for the discovery of polymorphs, a reference method for the discovery and in-depth study of betulin's polymorphs, and has the advantages of simplicity and speed.
Keyword：
Betulin; Polymorph; Thermal analysis; Characterization; Crystal form of dominant drug;
白桦脂醇(betulin)又名白桦酯醇、桦木醇、桦木脑，是从白桦树皮中提取的一种五环三萜类化合物，分子式为C30H50O2,分子量为442.38。白桦脂醇具有广泛的药理作用，如降血糖、抗炎、抑菌及抗癌等[1,2,3,4,5],但水溶性差，生物利用度低，限制了其进一步研究与临床应用。固体化学药物存在多晶型现象，同种物质的不同晶型由于排列方式和排列规律不同，其理化性质、生物利用度和药理性质等可能不同[6]。通过对固体化学药物进行多晶型研究，可发现药物的不同晶型，从而探究稳定性较好、生物利用度高且安全有效的优势药物晶型[7]。白桦脂醇已有11种溶剂合物[8,9,10,11]和1种白桦脂醇半水合物报道[12]。本课题组在中国专利CN109988215A中公布了白桦脂醇晶B型[13],专利CN109988214A中公布了白桦脂醇晶C型[14],专利CN109988216A中公布了白桦脂醇晶D型[15]。通过对市售的白桦脂醇进行粉末X射线衍射法(powder X-ray diffraction, PXRD)表征，发现其PXRD图谱与已报道白桦脂醇的多晶型图谱不一致，故将其命名为晶A型。在本研究中，采用晶A型作为起始晶型，研究白桦脂醇的3种无溶剂的晶B型、晶C型、晶D型制备方法。在此基础上，对4种晶型进行差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)、热重法(thermogravimetry, TG)、PXRD表征以及溶解度、稳定性的评价研究工作。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与试药
白桦脂醇购自南京泽朗医药科技有限公司(含量>99%);高效液相色谱法(HPLC)使用的溶剂为色谱纯，购自美国Fisher公司；其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为纯净水。
1.1.2 仪器
差示扫描量热仪(DSC1型，瑞士Mettler Toledo公司);热重分析仪(TGA/DSC1型，瑞士Mettler Toledo 公司);粉末X射线衍射仪(Rigaku D/max-2550,日本理学 Rigaku 公司);电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9035A,上海一恒科技有限公司);溶出实验仪(RC12AD型，天大天发有限公司，配 RZQ-12D 取样收集系统);高效液相色谱仪(Agilent 1200,美国Agilent 公司，配 DAD检测器)。
1.2 实验方法
1.2.1 多晶型制备
依据白桦脂醇晶A型的DSC图谱，分别选择160,220 ℃作为多晶型筛选及制备的温度。取白桦脂醇原料药适量，将其置于160 ℃的干燥箱中，加热后得到无溶剂的晶B型；将晶B型置于220 ℃的干燥箱中，加热后得到晶C型；晶C型可通过加热熔融或者研磨法得到晶D型。
1.2.2 DSC分析与TG分析
DSC分析：精密称取样品3～5 mg, 置于40 μL标准带盖铝坩埚中，用空铝坩埚做参比，在大气气氛下设置升温速率为10 ℃·min-1,采用STARe数据处理软件处理图谱。
TG分析：精密称取样品3～5 mg, 置于氧化铝坩埚(6.0 mm×4.5 mm)中，在50 mL·min-1的氮气保护下设置升温速率为10 ℃·min-1,扫描范围：30～500 ℃,采用STARe数据处理软件处理图谱。
1.2.3 PXRD分析
使用粉末X射线衍射仪对白桦脂醇4种晶型以及稳定性实验样品进行PXRD表征，实验条件：CuKα辐射，λ=1.541 84Å,管压40 kV,管流150 mA,2θ扫描范围在3°～80°,步长0.02°,扫描速度为8°·min-1。
1.2.4 稳定性考察
按稳定性考察要求，称取白桦脂醇4种晶型样品各50 mg, 置于培养皿中，每个样品3份，分别置于高温[(60±1 ) ℃] 、高湿[(90±5)%,25 ℃]、光照[(4500±500) lx, 25 ℃]条件下，并于第0天、第5天和第10天取样。利用PXRD测定第5天、第10天的样品，扫描范围为3°～80°,并与原始数据进行比较，作为考察4种晶型稳定性的依据。
1.2.5 溶解性评价
采用HPLC法对白桦脂醇4种晶型进行溶解度考察实验。HPLC实验条件为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)。流动相：乙腈：水(V:V)=90:10。流速：1.0 mL·min-1,柱温：30 ℃,进样量：10 μL。检测波长：210 nm。
2 结果
2.1 DSC与TG测定结果
在程序控温下，DSC可测量物质的能量与温度变化的关系，TG可检测物质的质量与温度变化的关系[16]。相同物质的不同晶型的热力学行为一般不同，可通过DSC和TG进行测定，综合分析后区分不同晶型。
在白桦脂醇晶A型的DSC图谱中存在3个吸热峰，其中前两个吸热峰峰形较宽，峰值温度(PEAK)值分别为95.9,203.3 ℃;第3个吸热峰较尖锐，PEAK值为260.5 ℃(图1)。晶A型的TG图谱(图2)显示，在50～150 ℃范围内存在一个0.67%的失重台阶，该范围与其DSC图谱中第1个吸热峰的温度(95.9 ℃)对应，从而确定白桦脂醇晶A型含有少量溶剂且其DSC的第1个吸热峰为溶剂峰。
将白桦脂醇晶A型置于160 ℃(其第1个吸热峰95.9 ℃和第2个吸热峰203.3 ℃温度之间)干燥箱中加热去溶剂，得到晶B型。晶B型DSC图谱中含有2个吸热峰，其PEAK值分别为204.1,260.3 ℃;其TG图(图2)只有一个失重台阶，为不含溶剂的白桦脂醇。故推断晶B型的DSC图谱中第1个吸热峰(204.1 ℃)为转晶点，第2个吸热峰(260.3 ℃)为熔融过程。选择在220 ℃时将晶B型加热，获得了晶C型。晶C型的DSC图谱中只含1个尖锐的吸热峰，其峰值为260.0 ℃;其TG图(图2)只有一个失重台阶，为不含溶剂的白桦脂醇。将晶C型加热熔融或者研磨可得白桦脂醇的无定型晶D型。晶D型的DSC图谱中存在3个放热峰和1个吸热峰，3个放热峰的峰值分别为109.0,137.4和197.1 ℃,最终在260.3 ℃吸热熔融。白桦脂醇晶D型的TG图(图2)只有一个失重台阶，为不含溶剂的白桦脂醇。白桦脂醇4种晶型的DSC图谱及数据见图1、表1,4种晶型的TG图谱及数据见图2、表2。
2.2 PXRD分析
PXRD是定性和定量研究药物多晶型的重要方法[17],同种物质不同晶型的粉末图谱会有不同位置和强度的衍射峰。将白桦脂醇4种晶型的实验粉末图进行比较，结果见图3所示。由图3可知，与晶A型相比，晶C型衍射峰较为尖锐，且衍射峰位置增加、强度发生变化，与晶A型存在较大差异，为新晶型；晶D型为无定型，仅存在一个弥散衍射峰；晶B型与晶A型粉末图相比，粉末峰变尖锐但差异不明显，需结合其他表征手段加以区分。
2.3 稳定性评价
将白桦脂醇4种晶型样品放置于高湿、高温、光照条件下，分别于5,10 d后取出，通过PXRD表征以判断4种晶型的稳定性。结果显示，晶A型、晶B型、晶C型及晶D型均可以稳定存在，为白桦脂醇的稳定晶型。
2.4 溶解度评价
采用HPLC对白桦脂醇4种晶型的溶解度进行测定，由于白桦脂醇属于难溶性药物，在水、pH值6.8磷酸缓冲液、0.9%盐酸中均不溶解(未检测到白桦脂醇),故使用0.5%十二烷基硫酸钠溶液进行实验，增加白桦脂醇的溶解度，以对白桦脂醇不同晶型的溶解度进行区分。以时间为横坐标，白桦脂醇的溶解度为纵坐标绘制溶解度曲线(图4)。结果表明，在0.5%十二烷基硫酸钠溶液中，晶A型溶解度最差，新获得的3种晶型溶解性和溶解性质都有提高。其中，晶D型具有最明显的溶解性优势，溶解速率最快，溶解度最好；晶B型与晶C型相似，溶解速率虽不及晶D型，但均优于晶A型。结合4种晶型的稳定性性质，确定晶D型为优势药用晶型。
3 讨论
本研究通过对白桦脂醇晶A型的热力学行为进行分析，采用加热法和研磨法对白桦脂醇进行多晶型筛查，最终得到3种不含溶剂的晶型，即晶B型、晶C型、晶D型。其中晶D型在0.5%十二烷基硫酸钠中溶解性最好，且在稳定性实验考察条件下可以保持无定型状态，故将晶D型确定为白桦脂醇的优势药用晶型。本研究基于对药物的热力学性质进行分析后进行多晶型筛查，相比于传统筛查方式，本方法更具有目标性，提高了晶型筛查效率，缩短药物多晶型筛查的研究周期，可以加快药物多晶型研究和药用开发。
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