付航1 刘喜平1，2 张炜3 李沛清1
1 甘肃中医学院基础医学院，甘肃兰州730000；2 甘肃中医学院敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃兰州730000；
3 兰州大学第一医院，甘肃兰州730000
【摘要】目的：观察敦煌平胃丸对胃癌前病变（PLGC）模型大鼠胃黏膜组织Notch信号通路中Notch2和Jagged1表达的影响。方法：采用复合法建立PLGC大鼠模型，将32只大鼠随机分为4组，每组8只。敦煌平胃丸组用敦煌平胃丸浸膏按每日生药96 g / kg掺入饲料中喂养给药，共计12周。观察大鼠胃黏膜病理组织学变化；采用Western Blot检测Notch2和Jagged1蛋白表达；采用RT-PCR检测Notch2和Jagged1mRNA的表达。结果：PLGC大鼠胃黏膜组织Notch2 与Jagged1mRNA及蛋白表达较正常大鼠胃黏膜组织均明显上调（P＜0 05）。敦煌平胃丸能明显改善PLGC大鼠胃黏膜腺体萎缩、肠化增生，下调PLGC大鼠胃黏膜组织中Notch2 与Jagged1表达水平（P＜0 05）。结论：Notch2、Jagged1激活了Notch信号通路，在PLGC发生发展中有重要意义。敦煌平胃丸治疗PLGC可能与下调Notch信号通路中Notch2 与Jagged1表达有关。
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关键词 敦煌平胃丸；胃癌前病变；Notch2、Jagged1
【中图分类号】R285 5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)01-0018-04
胃癌前病变( gastric precancerous lesions, PLGC)是胃黏膜肠上皮化生（intestinal metaplasia，IM）和异型增生( Dysplasia，Dys)的一种病理状态。研究显示Notch信号通路参与了胃黏膜的癌变过程［1］。敦煌平胃丸源于敦煌遗书，该方临床治疗慢性萎缩性胃炎及胃癌前病变疗效确切［2-3］。为了进一步揭示敦煌平胃丸的药效及作用机理，本研究以PLGC大鼠为模型，研究了敦煌平胃丸对胃黏膜Notch信号通路中Notch2和Jagged1表达的影响，现报道如下。
1材料
1 1实验动物采用SPF级健康Wistar大鼠，体重（160±10）g，雌雄各半，标准饲料喂养，均由甘肃中医学院SPF级医学实验中心提供，动物许可证号：SCXK(甘)2011-0001-0001163。
1 2实验药物敦煌平胃丸（方药组成：人参、土鳖虫、当归、苦参、大黄、桔梗、干姜、防风、篙本、玄参），药材饮片购自兰州复兴厚药材有限责任公司，经甘肃中医学院中药鉴定教研室鉴定符合药典规定。将处方中药材饮片按一定比例，置多能提取器中，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮1 5h，第二次加6倍量水，煎煮1h，合并两次煎液，离心滤过，滤液减压浓缩至含生药2g/ml的浸膏，保存备用。
1 3试剂及仪器甲基硝基亚硝基胍（MNNG），购自上海国药集团化学试剂有限公司，批号M0527；Notch2及Jagged1抗体购自兰州维科生物工程有限公司（批号RMA0546）；胎牛血清购自兰州维科生物工程有限公司；EastepTM通用型总 RNA 提取试剂盒:型号LS1OO，普洛麦格上海生物产品有限公司；RNAse-Exitus PLUS（德国Applichem公司)，批号OD008558；超声波破碎仪（德国merck公司）；超微量分光光度计（K5500北京凯奥科技公司）；凝胶成像分析仪（170-8170，美国BIO RAD公司）；PCR热循环仪（C1000，美国BIO RAD公司）。
2方法
2 1大鼠模型建立及分组给药
2 1 1PLGC大鼠模型建立教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献方法［4］，采用复合法建立PLGC模型：用蒸馏水175ml和40℃50%的酒精75ml充分搅匀配成10g/l的母液250ml(每周配1次)，于4℃冰箱保存。使用前将MNNG加入母液，稀释成浓度为100μg/ml的溶液，避光保存。各造模组大鼠自由饮用MNNG与酒精复合溶液；各造模组大鼠雷尼替丁与 60℃150g/热盐水按2 25g/L混合后灌胃。各造模组大鼠均配合饥饱失常(2d饱食，1d禁食)。
2 1 2分组及给药32只大鼠适应性喂养7 d后，随机分为4组，每组8只：空白对照组，常规喂养；PLGC模型组，按照前述方法造模，常规喂养，共计12周；自然恢复组，按前述方法造模，常规喂养，共计12周，第13周造模结束后，继续常规喂养12周；敦煌平胃丸组，按照前述方法造模，常规喂养，共计12周，第13周开始，按每日生药96g/kg剂量（相当于60kg成人剂量的20倍计算），将敦煌平胃丸浸膏，掺入饲料中喂养12周。
2 2各组大鼠胃黏膜病理组织观察及积分将大鼠禁食24h后(自由饮水)，腹部注射20%乌拉坦(约10ml/kg)，剖腹取胃，沿胃大弯切开，PBS 溶液漂洗2遍后，肉眼观察大鼠胃壁弹性、黏膜色泽。剪取胃窦部胃组织，将其置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，染色，光镜下观察胃黏膜厚度，腺体排列及肠化增生情况。教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献方法［5］，分别从胃黏膜充血、炎性程度、胃黏膜糜烂程度、胃黏膜萎缩、肠化增生等方面进行评分。
2 3Western Blot检测各组大鼠胃黏膜组织Notch2和Jagged1蛋白的表达取胃窦组织，每100mg组织加1ml预冷的蛋白提取试剂，提取组织蛋白质。超声破碎仪粉碎组织，加入RIPA缓冲液匀浆，超微量分光光度计测蛋白质浓度；取100μl上清液，取相同质量的细胞裂解液，并加等体积的电泳加样缓冲液，沸水浴中3min，上样、电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA），电转膜仪转膜（100mA 40min），膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色，Western blot ECL试剂盒显色，采用博德公司的凝胶成像分析系统进行图像采集，并用Quantity One4 2软件分析目标条带蛋白与β-actins蛋白的积分光密度比值，计算相对量。
2 4RT-PCR检测各组大鼠胃黏膜组织Notch2和Jagged1 mRNA的表达取胃窦组织，提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA 的浓度和纯度。cDNA的合成采用5μl逆转录反应体系，42℃反应60min。反应条件：变性，95℃，2min；退火，42~65℃，1min，25~35循环；延伸，72℃，5min。使用Promega公司的GO Tap Green Master Mix 进行PCR扩增，将扩增物进行2 0%琼脂糖凝胶电泳。PCR引物由采用 Primer premier 5 及 Oligo 6 等生物软件进行引物设计，目的基因片段长度设计为100bp，内参片段长度设计为150bp。Notch2和Jagged1基因引物见表1。采用博德公司的凝胶成像分析系统进行图像采集，并用Quantity One4 2软件分析目标条带mRNA与β-actins的mRNA的积分光密度比值，计算相对量。
2 5统计学方法用IBM SPASS 19 0统计软件对数据结果进行处理分析，数据以均数±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析的方法，进行方差齐性检验后，组间的比较采用LSD与SNK法检验。检验水准为0 05。
3结果
3 1各组大鼠胃黏膜组织病理观察及积分结果见图1、表2。正常组大鼠胃黏膜腺体排列整齐，紧密呈管状，细胞层次清晰，腺上皮及基底层细胞排列规则，黏膜下平滑肌层完整，沿上皮排列，未见特异改变；PLGC模型组大鼠胃黏膜腺体可见结构紊乱、形态不规则、排列拥挤、并有复层及背靠背现象，细胞核极性消失，胞核增大、深染、异形，核呈空泡状，胞浆嗜碱，间质水肿，充血，淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞浸润；自然恢复组大鼠胃黏膜结构紊乱，形态不规则，部分区域灶状轻度增生腺或可见部分区域肠上皮化生；敦煌平胃丸治疗组大鼠胃黏膜异型增生较模型组有不同程度改善，主要为炎性改变。
3 2各组大鼠胃黏膜组织Notch2和Jagged1蛋白的表达结果见图2、表3。与正常大鼠胃黏膜组织比较，PLGC模型组大鼠胃黏膜组织Notch2 与Jagged1蛋白表达均明显上调（P＜0 05）。自然恢复组有所降低，但不显著。经敦煌平胃丸干预后Notch2 与Jagged1蛋白表达水平明显下降（P＜0 05），但仍高于正常组。
3 3敦煌平胃丸对PLGC大鼠胃黏膜组织Notch2 mRNA表达的影响结果见表图3、表4。与正常大鼠胃黏膜组织比较，PLGC模型组大鼠胃黏膜组织Notch2 与Jagged1mRNA表达均明显上调（P＜0 05）。自然恢复组有所降低，但不显著。经敦煌平胃丸干预后Notch2 与Jagged1 mRNA达水平明显下降（P＜0 05），但仍高于正常组。
4讨论
Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，进化上高度保守［6］。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体（DSL蛋白）、CSL(CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合称）DNA结合蛋白等组成。已知哺乳动物有Notch1、 Notch 2、 Notch 3、Notch4等4种Notch受体和Deltal、Delta3、Delta4、Jaggedl、Jagged2等5种配体。当Notch受体与邻近的细胞表面的配体相结合时，其胞内区被切割，从细胞膜上脱离，转运进入细胞核并与下游分子相互作用以传递Notch发挥生物学功能［7］。研究表明Notch信号转导系统中Notch1-3受体及Jaggedl、Jagged2、Delta1等配体在正常胃黏膜中都有表达，在胃癌组织中则呈现高表达［8］，提示Notch信号通路可能参与了胃黏膜的癌变过程。但Notch信号通路是否参与了PLGC发生发展，尚未见到相关报道。
PLGC属中医“胃痞”范畴。中医认为PLGC的发生是一个邪气渐深，正气渐伤的过程，这与“慢性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌”的疾病模式有相似之处。胃黏膜炎症经过长期病理演变，初起在经在气，以脾胃失和，气机阻滞为主，久则在络在血，寒湿、郁热、瘀血等邪毒蜂起，使胃络不通；久则耗伤正气，脾胃虚弱，气阴亏虚，胃络失于濡养，导致腺体萎缩、黏膜肠化增生，数证交错，相互挚制，从而使病势胶着，迁延不愈。故我们认为毒邪内蕴、胃络不通、胃络损伤是炎症诱导PLGC发生的关键病机；脾虚阳陷、气阴亏虚、胃络失养是PLGC的病理转归；虚实夹杂、寒热错杂是其主要证候特征。
基于上述认识，我们提出“消散毒邪，以通胃络，升阳健脾、益气养阴以养胃络”治疗PLGC的思路。敦煌平胃丸组方用药符合这一治疗思路，是我们临床治疗PLGC的常用方剂，疗效显著。该方源于敦煌遗书P·3287卷子［9］，由人参、土鳖虫、当归、苦参、大黄、玄参、干姜、防风、篙本、桔梗等组成。方中以土鳖虫、大黄、当归活血祛瘀，通经活络，以解瘀毒阻滞胃络；苦参、干姜辛开苦降，恢复中焦升降之职，以解寒湿、邪热内蕴毒邪，佐以甘寒濡润之玄参，与当归合用滋阴养血，防止久病入络，耗伤胃络阴血，又可制约方中辛苦温燥药物伤及阴血；防风、篙本、桔梗均为辛散升浮之品，与人参配伍共奏升阳健脾。全方虚实兼顾，寒热平调，润燥结合；既消散毒邪，畅通胃络，又升阳健脾、益气养阴，荣养胃络。
本研究结果表明PLGC模型大鼠胃黏膜组织Notch信号通路中受体Notch2 与配体Jagged1mRNA及蛋白表达较正常大鼠胃黏膜组织均明显上调。经自然恢复后这种高表达水平并未明显改变，敦煌平胃丸则能明显下调PLGC大鼠胃黏膜组织中Notch2 、Jagged1 mRNA及蛋白表达水平。我们推测Notch2 作为的受体、Jagged1作为配体激活了Notch信号通路，促进了胃黏膜腺体萎缩、肠化增生。敦煌平胃丸治疗PLGC可能与下调Notch信号通路中Notch2 与Jagged1表达，促进胃黏膜组织修复与重构有关。至于PLGC过程中是否还有其他Notch信号通路受体及配体或相关下游基因参与，敦煌平胃丸对其是否具有干预调节作用，有待于进一步研究。
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(收稿日期：2014 10 07)